肿瘤免疫治疗研究进展

张亚娟综述 常 德 张健鹏审校

·综述与讲座·

肿瘤免疫治疗研究进展

张亚娟综述 常 德 张健鹏审校

肿瘤免疫治疗；主动免疫治疗；过继性细胞免疫治疗

免疫系统的功能状态在肿瘤的发生、发展中起到重要作用，对于肿瘤的发生、发展及预后具有重要的影响。基于肿瘤抗原的存在，机体针对肿瘤抗原具有免疫应答，包括特异性和非特异性免疫。然而，肿瘤抗原具有免疫原性低，肿瘤细胞存在免疫逃逸现象，肿瘤患者机体产生的免疫应答常不能抑制肿瘤生长，例如肿瘤抗原的缺失、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)类分子表达低下、共刺激信号异常、肿瘤形成过程中产生或分泌的免疫抑制因子(TGF-β、IL-10、IL-33等)以及肿瘤微环境中各种免疫抑制性细胞，包括骨髓来源的抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)等[1]。基于机体免疫和肿瘤发生发展的关系，目前研究主要围绕如何提高肿瘤细胞的免疫原性和调控肿瘤细胞的免疫逃逸2个方面，包括肿瘤疫苗、过继性细胞免疫治疗、非特异性免疫调节剂等。

1 肿瘤主动免疫治疗

肿瘤的主动免疫治疗(active immunotherapy)也称为肿瘤疫苗，是指利用肿瘤细胞、肿瘤抗原、裂解物激活免疫系统产生特异性抗肿瘤细胞免疫效应，主要包括肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、DC疫苗、抗独特型抗体疫苗、DNA疫苗和细菌疫苗。肿瘤疫苗是一种新型治疗性的肿瘤主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，肿瘤疫苗在临床试验中和动物试验中已取得令人欣喜的成绩。作为一种低毒、高效、不良反应少的免疫疗法，肿瘤疫苗具有极大发展前景[2]。

1.1 肿瘤细胞疫苗

肿瘤细胞疫苗是采用灭活的自体或异体肿瘤细胞作为疫苗，导入患者机体，刺激机体产生主动免疫。但肿瘤细胞本身具有免疫原性弱、抗原封闭、MHC1类分子表达低下、共刺激信号异常等特点，不能有效地刺激机体产生抗肿瘤免疫应答，故肿瘤细胞疫苗中多加入佐剂(卡介苗、棒状杆菌等)、或通过基因重组技术修饰，即将编码免疫原性的肿瘤抗原基因或共刺激信号基因、增强免疫反应的细胞因子基因转染给肿瘤细胞，从而进一步增强肿瘤细胞的免疫原性，提高肿瘤疫苗的抗肿瘤效应。部分疫苗已在临床试验中得到证实。

1.2 肿瘤相关抗原疫苗

1.2.1 多肽疫苗 是指根据肿瘤抗原基因中已知或预测的某种抗原表位氨基酸序列，通过化学方法合成的疫苗，具有特异性高、制备简单、无潜在致癌性等特点，受到广泛关注。但受组织相容性复合体限制以及免疫原性较弱等缺陷，使其抗肿瘤效果不理想。因此，在制备多肽疫苗时，通常加入佐剂(GM-CSF、IL-2、HSP等)、联合树突状细胞(DC)、增加辅助性淋巴细胞(Th)表位等方法提高免疫原性，增强其抗肿瘤效应。研究最多的多肽疫苗大部分针对黑色素瘤，例如关于黑色素瘤辅助肽(6MHP)疫苗，其可诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞反应[3]。在其他肿瘤方面，例如去势抵抗性前列腺癌(CRPC),也称激素抵抗性前列腺癌，其预后差。一项个性化肽疫苗联合低剂量地塞米松和单独应用地塞米松Ⅱ期对照试验表明，37例接受肽疫苗接种患者较35例单独应用地塞米松患者，其无进展生存期(progression free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)明显高于对照组[4],但具体疗效将需要更多的临床试验数据支持。

1.2.2 蛋白疫苗 是以肿瘤抗原整个或部分蛋白作为免疫原，通过抗原提呈细胞摄取，刺激机体产生抗肿瘤免疫应答。有研究报道BLP25脂质体疫苗(L-BLP25，靶向MUC1肿瘤相关抗原核心多肽)对于不能手术切除的Ⅲ期非小细胞肺癌，其临床安全性耐受性较好。此外，MAGE-A3(黑色素瘤相关抗原3)蛋白疫苗(NSCLC、前列腺癌)、肺炎链球菌溶血素类毒素(d Ply)和三联组氨酸蛋白D(Pht D)疫苗的开发，多处于Ⅱ/Ⅲ期临床试验，应用前景值得期待[5-7]。

1.2.3 DNA疫苗 本质上也属于肿瘤抗原疫苗，主要是将编码肿瘤抗原的基因和载体结合，导入患者机体，利用载体本身的自我复制模式表达出肿瘤抗原，从而诱导机体产生免疫应答。相关报道指出PROSTVAC-VF疫苗在Ⅱ期临床试验中证实针对前列腺特异性抗原产生特异性T细胞反应，并且近期研究发现这种疫苗也能对痘病毒中的碳水化合物产生体液应答，该试验包括超过100名患者组成的2个独立样本组，研究结果提示体液反应与总生存期有统计学显著相关性(P=0.015和0.008)，表明该病毒聚糖体液应答与PROSTVAC-VF生存相关，可为疫苗的开发提供独到的切入点[8]。

1.3 树突状细胞(DC)疫苗

DC细胞是体内少有的功能强大的抗原递呈细胞，具有激活CD8+细胞毒性T细胞及CD4+辅助性T细胞的功能。未成熟的DC细胞具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活自体肿瘤相关特异性CD8+细胞毒性T细胞，降低肿瘤负荷量[9]。DC疫苗可分为肿瘤抗原致敏和基因修饰改造的DC疫苗。通过采用患者自体的外周血单核细胞在体外培养，然后负载不同形式的肿瘤抗原，或者将编码肿瘤抗原的基因通过相应的载体转入DC，再将这些DC细胞接种或回输给患者，刺激体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞增殖，从而产生抗肿瘤免疫应答，达到消灭肿瘤细胞的目的。

Sipuleucel-T疫苗是2010年4月29日第一个被美国FDA批准的肿瘤治疗性疫苗，由PA2024(前列腺相关蛋白-前列腺酸性磷酸酶和GM-CSF融合蛋白)与DC细胞组成，有研究报道该疫苗能延长前列腺癌晚期患者生存时间[10]。Kyte等报道了转染自体黑色素瘤基因或mRNA的3种前列腺癌细胞系(DU-145，LN帽和PC-3)的树突状细胞，用于黑色素瘤和前列腺癌的基因免疫治疗，在Ⅱ期临床试验中发现47.4%(9/19)的黑色素瘤患者和63.2%(12/19)的前列腺癌患者有特异性T细胞反应，显示出一定的有效性[11]。

2 肿瘤被动免疫治疗

肿瘤被动免疫治疗又称过继性免疫治疗(adoptive cell transfer therapy，ACT)，是被动性地将具有抗肿瘤活性的免疫制剂或体外培养、活化的免疫效应转输给肿瘤患者，达到治疗肿瘤的目的。对免疫能力低下的患者如血液病、器官移植术后患者尤其适用[12]。过继性细胞免疫治疗根据其发展历程依次为自体淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer，LAK)[13]、自体肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infil-trating lymphocytes，TIL)、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)、细胞毒性 T 细胞(cytotoxicT lymphocyte，CTL)以及经基因修饰改造的T细胞(CAR-T、TCR-T)。目前基因修饰改造的T细胞，已经成为ACI研究的新热点，尤其是CAR-T细胞，其最大的优势在于通过非MHC限制性发挥抗肿瘤作用[14]和肿瘤抗原的选择不仅仅局限于蛋白质类物质，还可以靶向糖类、糖脂类[15]。

2.1 TIL细胞

肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)是从肿瘤部位分离出的淋巴细胞，在体外经IL-2等细胞因子扩增后产生，其表型以CD4+T细胞和CD8+T细胞为主，具有一定的肿瘤特异性和MHC限制性。在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等方面关于TIL相关临床试验迅速开展，但未取得明显的临床效果。Ibrahim研究发现通过病理检查发现三阴性乳腺癌TIL的存在是无病生存期和总生存期预后的指标[16]。最新研究发现TIL抗肿瘤效应与众多共刺激信号和共抑制信号有关，这些共抑制信号被称作免疫检查点，因此如何阻止抑制信号途径的表达，来增强T细胞杀伤作用是肿瘤免疫治疗策略之一。如抗 PD-1的人源化单克隆 IgG4 抗体(Nivolumab)，在NSCLC、转移性黑色素瘤临床试验中具有显著疗效[17]。

2.2 NK细胞

NK细胞免疫治疗受到众多研究者的关注，相关抗体已经用于黑色素瘤、肺癌和肾癌的治疗。NK细胞属于先天免疫系统，与T细胞不同，在发挥抗肿瘤效应前，不需要肿瘤特异性识别或者克隆扩增。NK细胞抗肿瘤效益，受细胞表面上大量受体的控制，抑制性受体(KIR，killer immunoglobulin-like receptor)是非常重要的一种，能够识别几乎所有有核细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子，阻止NK细胞的激活。这种自身耐受机制能够防止潜在的宿主细胞杀伤，通过病原体或肿瘤细胞中的MHC Ⅰ类分子表达缺乏或降低，从而激活NK细胞，对肿瘤细胞发挥攻击作用。

基于杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和程序性死亡-1(PD-1)免疫受体下调NK细胞和T细胞的活性这一原理，2011年BMS开始进行利用抗KIR抗体(lirilumab)针对血液系统肿瘤和实体瘤的6种组合疗法试验，至2013年，已经有3例患者接受治疗，具体临床疗效及数据尚未公布[18]。

2.3 CIK细胞

CIK细胞是外周血单个核细胞经抗CD3单克隆抗体，以及IL-2、IFN-γ、和IL-1α等细胞因子体外诱导分化获得的NK样T细胞，呈CD3+CD56+表型，既具有非MHC限制性特点，又有T淋巴细胞抗肿瘤活性。正常人外周血中CD3+CD56+T仅占1～5%，但体外经扩增后可大量增殖，具有培养快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等特点，同时对多药耐药肿瘤细胞也具有杀伤作用[19]。

将DC细胞与CIK细胞联合培养是目前研究和应用最广泛的一种治疗方式。已有研究证实CD4+CD25+Treg细胞能够抑制细胞毒性 T 细胞介导的免疫反应，抑制 CIK 细胞的抗瘤活性。最新的一项研究报道了 DC-CIK 细胞联合化疗对多发性骨髓瘤(MM)的临床疗效及其对CD4+CD25+Treg细胞的影响。该研究将42名MM患者随机分为化疗组和联合治疗组，20例患者只采用化疗方案，22名患者采用化疗+过继免疫疗法(DC-CIK)，治疗3周后，联合治疗组生活质量、寿命、临床指数均高于化疗组(P<0.05)，而CD4+CD25+Treg细胞联合治疗组低于化疗组(P<0.05)[20]。因此，笔者认为DC-CIK 细胞联合治疗恶性肿瘤安全有效，且能有效提高患者抗肿瘤能力，改善生存情况。 Han等报道了1项DC-CIK 联合培养对晚期非小细胞肺癌的治疗安全性的系统评价和分析，化疗联合DC-CIK免疫治疗的优势表现在疾病控制率(DCR)(P=0.006)，1年总生存期(OS)(P=0.02)和无进展生存期(PFS)(P=0.005)，与对照组相比差异显著，且不良事件发生少，而在客观缓解率(ORR)、部分缓解(PR)、2年OS和PFS无明显的改善，总体评价认为联合治疗更安全，适用于晚期非小细胞肺癌患者[21]。

2.4 T细胞

T细胞识别抗原的特异性主要由T细胞受体(TCR)决定的，因此通过转导肿瘤相关抗原反应性T细胞克隆的TCR基因，成为过继性免疫治疗的很有潜力的治疗方法。目前较为经典的CAR结构包括识别肿瘤表面抗原的抗体scFv区、促进与肿瘤细胞表面近侧抗原结合的铰链区、固定CAR的跨膜区、增强T细胞活化的共刺激区和T细胞活化信号转导CD3ζ链。对于CAR结构来说，最为重要的部分为共刺激信号元件，这些共刺激信号元件可增强CAR-T的激活和抗肿瘤效应。近年来，随着 CAR 结构的不断优化与改进，CAR-T 在治疗血液系统肿瘤方面具有较好的效果，尤其是B 细胞恶性肿瘤，因为B细胞以及 95% 以上的B细胞恶性肿瘤表面均特异性表达 CD19，且在不同分化阶段均持续表达[22]。2014 年Kochenderfer 等又公布了一项 CAR-T 疗法治疗15例晚期B细胞恶性肿瘤(9例弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，2例惰性淋巴瘤，4例慢性淋巴细胞白血病)，在接受环磷酰胺化疗和氟达拉滨化疗后单次输注抗CD19 CAR-T细胞后，8例达到完全缓解(CRS)，4例取得部分缓解，1例处于稳定的淋巴瘤，2例无法评估。这些结果再次证明抗CD19的CAR-T治疗难治性B细胞恶性肿瘤的可行性和有效性[23]。Keisuke等报道了由靶抗原密度控制的抗-CD20-CD28-CD3ζ嵌合抗原受体修饰效应CD8 T细胞在对抗CD20下调的肿瘤细胞和CD20+的淋巴组织恶性肿瘤中也有明显的裂解活性和有效性[24]。

CAR-T细胞在实体瘤方面的应用，不同于血液系统肿瘤，实体瘤中缺乏像CD19、CD20这样相对较理想的特异性表面抗原，应用于实体瘤的临床试验还很有限，故寻求特异性肿瘤抗原是实体瘤CAR-T治疗急需解决的问题。CAR-T 细胞疗法作为一种新型细胞免疫治疗方法，在发挥抗肿瘤的同时也产生了严重的甚至致命的不良反应。目前在临床试验中，正常组织的靶向损伤和细胞因子风暴(cytokine released syndrome，CRS)是CAR技术应用过程中的两大安全问题：①脱靶效应。首先大多数 CAR 定向的靶抗原并不是理想的肿瘤特有抗原，在正常组织中也有不同程度的表达，CAR-T细胞在攻击肿瘤组织的同时也会对正常组织产生排斥反应。针对上述问题，相关研究指出正常组织一般只表达一种抗原，可以设计包含2种或2种以上嵌合抗原受体T细胞，正常组织细胞就可以避免受到 CAR-T 的损伤[25]。②细胞因子释放综合征(CRS)。CAR结构的不断优化及改进，使得T细胞活化、增殖、杀伤能力大幅度增强，同时在细胞治疗过程，如白介素 (interleukin，IL)-1、IL-6、γ-干扰素等细胞因子大量释放到血液循环中，可引起高热、低血压、恶心、头痛、心动过速、呼吸急促等症状，严重者可导致急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭，这与大量激活的T细胞介导的急性抗肿瘤反应有关[26]。针对这一问题，可使用甾体类固醇药物、升压药及其他对症支持治疗。2014年Davila等总结了根据CRS严重程度，选择最佳时机应用糖皮质激素，既可以充分发挥抗肿瘤效应，同时又可避免严重不良反应的发生[27]。CAR-T引起的CRS与传统药物引起的副作用不同，不能通过减少药物用量来控制，只要肿瘤细胞存在，效应细胞就会不断产生，因此将T细胞的总量分多次回输或者在肿瘤负荷减小后应用CAR-T细胞，可以在一定程度上减少细胞因子风暴这种不良反应。

综上所述，肿瘤免疫治疗是21世纪肿瘤治疗的主要方向，与手术切除、放疗及化疗这些传统方法相比，肿瘤免疫治疗的优势主要利用自身的免疫调节作用，以达到抗肿瘤作用，其毒副作用小，不良反应事件少，尤其适用于不适合手术且有广泛转移的恶性肿瘤患者。因此，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤临床治疗的热点，在多项临床应用中取得了瞩目的成果。但在临床实践中仍存在许多问题，例如如何提高肿瘤疫苗的免疫原性，如何制备既能激活CD4+T细胞又能激活CD8+T细胞的肿瘤疫苗，还需更多的基础研究及基因工程技术的支持。关于CIK 细胞联合治疗，虽然目前的临床试验证实了CIK联合治疗在一定程度上可延长患者的生存期及提高生活质量，但大多数临床治疗的结果来源于非标准化的临床研究，还需要进行大样本多中心随机对照试验，证实CIK细胞联合治疗的临床疗效。此外，嵌合抗原受体 T 细胞疗法(CAR-T)代表最先进的技术，越来越受到大家的重视，其临床试验结果显示出了较好的应用前景，然而在技术提升和大规模临床应用方面，CAR-T 仍然存在着许多挑战，如何提高 CAR-T 细胞特异性抗肿瘤能力以及安全性，是目前 CAR-T 治疗急需解决的问题。

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(编辑：甘 艳)

国家自然科学基金项目(编号：81402471)；武警总医院培育项目(编号：WZ201406)

100039 中国人民武装警察部队总医院(张亚娟，常 德，张健鹏)；121001 锦州医科大学(张亚娟)

常 德

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.052

R730.5

B

1001-5930(2017)04-0693-04

2016-06-23

2016-11-04)