结肠癌血性腹腔积液动物模型的建立

胡 叶 杨 萌 周 琴 王毛毛 齐 慧 左明焕

·基础研究·

结肠癌血性腹腔积液动物模型的建立

胡 叶 杨 萌 周 琴 王毛毛 齐 慧 左明焕

目的 建立结肠癌血性腹腔积液的动物模型，用于恶性腹腔积液防治的实验研究。方法 以BALB/c雌性裸鼠为实验对象，采用脾脏注射细胞数为5×106/ml的人结肠癌SW480细胞悬液100 μl，观察裸鼠腹腔积液产生情况、腹腔瘤体制作病理标本检测。结果 11只小鼠15天存活率为100%，30天存活率为72.72%(8/11)，出现腹腔积液率为100%，肉眼观察腹腔积液呈暗红色，质浑浊。病理结果示腹膜转移瘤细胞符合低分化腺癌的特征，检测腹腔积液中红细胞数进一步证明为血性腹腔积液。结论 经脾脏接种人结肠癌SW480细胞可成功建立结肠癌血性腹腔积液的动物模型，具有操作简单、可控性强、存活率高等特点，是研究结肠癌血性腹腔积液的理想动物模型。

血性腹水；结肠癌；动物模型

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:175～177)

结肠癌(colon cancer)是当前较常见的消化系统恶性肿瘤之一。近年来其发病率呈明显上升趋势。结肠癌血性腹腔积液(colonic bloody ascites)患者多处于结肠癌晚期，临床上不仅表现原发病的症状、体征及恶病质，更为严峻的是因腹腔积液的迅速增长、腹腔压力增高从而引起腹胀腹痛、食欲下降、恶心呕吐，甚至导致呼吸困难等，严重降低了患者的生活质量，同时更延误了积极的治疗机会，甚至会引起营养匮乏、病情恶化，使生存期明显缩短[1]。由于结肠癌血性腹腔积液发病机理复杂，临床疗效欠佳，故需建立稳定、可行的结肠癌血性腹腔积液动物模型以明确结肠癌血性腹腔积液的产生机理，提高结肠癌血性腹腔积液的临床疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性BALB/c裸鼠11只，鼠龄6～8周，体重 20～25 g，洁净度SPF级，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[生产许可证号：SCXK(京)2009-0004]。分笼饲养于屏障系统内，室温控制在(25 ℃±1 ℃)，相对湿度40%～50%。

1.2 肿瘤细胞

人结肠癌SW480细胞株购自美国模式培养物集存库(ATCC)，培养于含10%胎牛血清及含青霉素、硫酸链霉素的L-15培养液中。

1.3 肿瘤细胞悬液的制备

将SW480细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的DMES营养液L-15培养液(含青霉素100×103U/L和链霉素100 mg/L)中，置于37 ℃、含5% CO2的恒温培养箱内。该细胞呈贴壁生长，取指数生长期的细胞，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3～1∶5扩培，细胞长至对数生长期，机械吹打成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加适量生理盐水调整细胞浓度至5×107/ml，以台盼蓝测定细胞活力在95%以上。

1.4 SW480细胞脾脏内接种建立模型

用1%戊巴比妥钠0.15～0.20 ml(50 mg/kg)对11只BALB/c雌性裸鼠腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后，固定小鼠呈仰卧位，于左腹中部、左侧腋前线与腋中线间，取5 mm切口进腹，逐层剥离找到柳叶状脾脏，小心显露脾脏，使脾上极托于切口外，用0.3 ml注射器31G针头从脾上极进针约6 mm，进针方向与脾脏长轴平行，将肿瘤细胞悬液注入至脾被膜下，缓慢注入细胞浓度为5×107/ml的SW480细胞悬液100 μl，可见注射部位的脾被膜发白、肿胀，待白色肿胀被膜消退后拔出针头，压迫止血约数秒，查无出血，把脾脏回纳入腹腔内。单层、间断缝合腹壁切口，关腹。

1.5 观测指标

术后裸鼠常规喂养，每日观察裸鼠的摄食、进水、活动等情况。每天早晨9点测量并记录小鼠体重、腹围(腹围测量标准为仰卧位两侧髂骨上缘连线绕腹部一周)。所有死亡小鼠均经剖腹收集腹腔积液，检测腹腔积液中红细胞计数，观察腹腔内肿瘤生长情况，剥离腹膜组织，用于腹膜转移瘤组织病理学观察。

2 结果

2.1 大体观察

小鼠接种初期活跃如常，体形无改变。7天后小鼠左侧腹部隐约可见膨大。15天小鼠腹部渐膨隆，行动渐迟缓，精神较前差，摄食量减少；麻醉2只小鼠后用剪刀延腹正中线剖开腹部皮肤约1 cm，不伤及皮肤下层筋膜，观察腹腔可见少量液体生成。接种后第25天可见小鼠腹部膨隆，剪开2只小鼠腹腔皮肤，不伤及皮肤下层筋膜，可见腹腔内血性液体，第28天2只小鼠死亡，第29天1只死亡，第30天处死其余小鼠，30天存活率为72.72%(8/11)，11只小鼠平均生存期为29.55天。

2.2 解剖发现

腹腔积液：1只于第29日夜间死亡无法采集腹腔积液，肉眼可见腹腔内有血性液体凝集块。其余10只均有腹腔积液产生，肉眼观察呈暗红色，质浑浊，量不等。平均腹腔积液量为(177.27±210.19)μl。腹腔积液中红细胞计数平均值为(1.67±1.56)×109/L。

瘤灶：解剖后可见脾脏上较大瘤灶，直径为0.3～0.5 cm，肝脏表面可见灰白色转移灶弥散分布，腹膜及肠系膜转移瘤散在分布，转移结节融合成块，数目有个体差异。

2.3 病理观察

对腹腔转移瘤HE染色，镜下观察见癌细胞聚积成团，癌细胞分化差，异型性明显，细胞呈梭形，胞质少，核大、深染且不规则，核仁明显，核分裂像易见。瘤组织内血管丰富，多处部位可见肿瘤明显侵袭小血管和淋巴管，形成众多癌栓，呈明显浸润性生长，肿瘤侵袭直至黏膜下层。11只裸鼠均见壁层腹膜转移。

3 讨论

3.1 实验动物与细胞株的选择

移植性肿瘤动物模型是目前肿瘤药物研究中应用最为广泛的动物模型,是将源于人或动物的肿瘤细胞或组织移植到动物体内而形成肿瘤动物模型的方法。按动物种类可分为裸鼠、大鼠、小鼠等；按照细胞来源可分为人癌细胞和动物癌细胞。动物结肠癌细胞研究结果不一定能对临床进行有效预测，且目前可知的鼠结肠癌癌细胞系较少，故该细胞较少选用。移植性肿瘤动物模型主要包括同种移植(动物之间)和异种移植(人与动物之间)两种[2]。异种移植结肠癌动物模型是将人源结肠癌细胞株或结肠癌组织块直接移植到免疫缺陷型小鼠而建立的模型。该模型建模方法简单，易观察，成瘤率高，建模周期短，模型稳定，并能较好地反应肿瘤的侵袭性、生长情况、药物敏感性等，因而成为常用的结肠癌动物模型[3-4]。基于以上理论，我们选用人结肠癌SW480细胞和裸鼠进行模型设计。

3.2 腹腔积液性质的确定

小鼠的腹壁均可见腹膜转移瘤，病理结果提示腹膜转移瘤细胞符合低分化腺癌的特征，说明腹腔积液的形成与腹壁转移瘤密切相关。在预实验中，我们曾将腹腔中抽取到的血性腹腔积液直接接种在正常小鼠腹腔内，14天后该小鼠同样产生血性腹腔积液，颜色、性状等同所接种腹腔积液一致，可见腹腔积液中存在肿瘤细胞。综上所述，可以确定实验小鼠腹腔内的血性腹腔积液为恶性腹腔积液。同时，实验裸鼠的腹腔积液中红细胞计数平均值为(1.67±1.56)×109/L，明显低于正常6周SPF级BALB/c雌性小鼠静脉血中红细胞数量(5.11±0.93)×109/L[5]。可见小鼠腹腔中液体并非腹腔内血管破裂，血液直接流入腹腔所致；而是由于腹腔内血管渗透压改变，血管内物质外渗入腹腔所致，符合腹腔积液的产生机制，故该液体性质为血性腹腔积液。

3.3 脾脏注射方法建立稳定的有应用价值的血性腹腔积液模型

恶性腹腔积液常发生在恶性肿瘤晚期，其治疗方法主要为引流胸腹腔积液、全身或局部化疗、纠正低蛋白血症等。对恶性腹腔积液的认识和治疗研究相对较少，国内外文献中均罕见恶性腹腔积液动物模型的报道，而在恶性肿瘤肝转移模型的文献中发现关于恶性腹腔积液产生的记录[6-10]，其中Nano[7]、许勤等[10]在通过脾脏接种法分别制作大鼠和小鼠结肠癌细胞肝转移模型的实验中均提及实验动物腹腔内可见体积不均等的血性腹腔积液。脾脏为免疫器官，对肿瘤的转移起到了筛选作用，而直接脾脏注射的肿瘤细胞更容易逃逸大量活化的、能分泌肿瘤坏死因子(TNF)的吞噬细胞及自然杀伤细胞的攻击，提高自身血行转移能力[11-12]；与此同时，脾脏内的肿瘤细胞随血液进入肝脏，随肝脏血流进入腹腔，形成腹膜转移瘤，促进恶性腹腔积液生成。脾脏接种法能较好的模拟人结肠癌血性腹腔积液产生的病理过程，是1种简单、有效、重复性好的建立模型方法。

我们曾尝试采用多种结肠癌肿瘤细胞腹腔内注射建立本模型，虽然人SW480细胞和鼠CT26细胞通过腹腔内直接接种在小鼠腹腔内成瘤性良好，但在建模30天内均未见腹腔积液生成。采用人LOVO细胞腹腔注射时，30天内能够产生少量白色半透明腹腔积液，但未见血性腹腔积液生成。多次实验发现，在SW480细胞脾脏接种建立的结肠癌血性腹腔积液模型中，血性腹腔积液生成率可达100%，并且荷瘤小鼠平均生存期大于29.55天，明显长于许勤等[10]报道的18.2±1.8天。这一特点使得SW480结肠癌血性腹腔积液模型能为包括药物治疗，生物治疗在内的各种临床前实验提供较长的治疗窗口期。虽然，本次实验样本量较小，腹腔积液生成量的不均一等问题也有待于进一步研究并加以解决，但这一稳定的结肠癌血性腹腔积液动物模型仍不失为研究结肠癌血性腹腔积液的病理机制和药物干预效果的重要工具。

[1] 袁 莉,孙 韬,周 琴,等.华蟾素注射液腹腔灌注治疗恶性腹水腹水102 例的临床观察〔J〕.中国医药导报,2014,11(22):54-59.

[2] 秦 川.实验动物学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2010:191-192.

[3] Jin K,Teng L,Shen Y,et al.Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice:a systematic review〔J〕.Clin Transl Oncol,2010,12(7):473-480.

[4] Rubio-Viqueira B,Hidalgo M.Direct in vivo xenograft tum- or model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients〔J〕.Clin Pharmacol Ther,2009,85(2):217-221.

[5] 陆春丽,黄小琼,邝少松,等.SPF级BALB/C小鼠血常规值的测定及性别和年龄对其影响的研究〔A〕.见:第六届中南地区实验动物科技交流会论文汇编〔C〕.北京:中国实验动物学会,2006:225-229.

[6] Ishizu K,Sunose N,Yamazaki K,et al.Development and c- haracterization of a model of liver metastasis using human colon cancer HCT-116 cells〔J〕.Biol Pharm Bull,2007,30(9):1779-1783.

[7] Nano R,Barni S,Chiari P,et al.Efficacy of boron neutron capture therapy on liver metastases of colon adenocarcinoma:optical and ultrastructural study in the rat.〔J〕.Oncol Rep,2004,11(1):149-153.

[8] Rajput A,Martin I DS,Rose R,et al.Characterization of HCT116 human colon cancer cells in an orthotopic model〔J〕.J Surg Res,2008,147(2):276-281.

[9] Thalheimer A,Otto C,Bueter M,et al.The intraportal injection model:a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer〔J〕.BMC Cancer,2009,9(29):1-7.

[10] 许 勤,吴文溪,马利民,等.小鼠结肠腺癌肝转移模型的建立〔J〕.实用癌症杂志,2000,15(5):456-457.

[11] 杨剑锋,张 森,高 枫,等.结直肠癌肝转移动物模型的建立〔J〕.结直肠肛门外科,2009,15(3):139-143.

[12] Bouvet M,Tsuji K,Yang M,et al.In vivo color-coded imaging of the interaction of colon cancer cells and splenocytes in the formation of liver metastases〔J〕.Cancer Res,2007,66(23):11293-11297.

(编辑：吴小红)

Establishment of a New Animal Model for Colon Cancer with Bloody Ascites

HUYe,YANGMeng,ZHOUQin,etal.

DongfangHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing,100078

Objective To establish a mice model of colonic bloody ascites for the experimental studies of prevention and treatment of malignant ascites.Methods BALB/c female mice were injected with 5×106human SW480 cells into the spleen.The quality and quantity of ascites in nude mice were observed as well as abdominal tumor pathological samples were tested.Results 11 mice 15-day survival rate was 100%,while 30-day was 72.72%(8/11).The ascites turned 100% in generation rate,with visually dark red,muddy quality.Pathology results indicated that tumor cells conformed to the characteristics of low differentiated adenocarcinoma and erythrocyte count of the ascites manifested the malignant and bloody property of ascites.Conclusion The model of human carcinomatosis bloody ascites in nude mice by spleen inoculation of SW480 is a simple,reliable,effective and strongly operational method of modeling.

Bloody ascites;Colon cancer;Animal model

国家自然科学基金项目(编号81373832)

100078 北京中医药大学东方医院肿瘤科(胡 叶，周 琴，王毛毛，左明焕)；102200 安泰康生物技术(北京)有限公司(杨 萌，齐 慧)

左明焕

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.001

R735.3+5

A

1001-5930(2017)02-0175-03

2016-04-01

2016-10-13)