肾脏常温灌注的研究进展

涂金鹏，付迎欣（天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 300192）

目前由于器官短缺，越来越多的边缘供体（expanded criteria donors， ECD）投入了临床使用。在美国，1999-2005年，ECD供肾的数量增加了36%，2009年ECD供肾占美国移植肾脏的22%［1］。ECD供肾的应用，加大了可供选择的器官来源，但同时面临着供体质量下降的问题，使其应用陷入了两难的境地。ECD供肾移植物丢失的相对风险超过标准供肾的1.7倍，1年和3年移植物存活率分别减少15%和16%［2］。

在过去的几十年中，低温静态保存（static cold storage， SCS）一直是最主要的保存方式，循环停止后，组织代谢仍可持续一段时间。然而，氧气和营养的缺乏会导致肾细胞内迅速出现严重的代谢问题。在保存期间，代谢的抑制是保持器官活性必不可少的。肾脏的核心温度低于4℃将导致大多数细胞的代谢降低至5%～8%，并降低酶的活性。然而，低温保存仍会产生一些不良影响，如：细胞水肿、酸中毒、酶活性改变、钙积聚、活性氧（reactive oxygen species， ROS）的产生等［3］。

随着ECD供体的大量应用，低温机械灌注（hypothermic machine perfusion ，HMP）被广泛应用，并已证实HMP对改善ECD供肾移植预后具有一定意义［4］。然而，哺乳动物细胞复杂的生物功能仅在一个狭窄的特定温度范围内有效，常温机械灌注（normothermic machine perfusion， NMP）的基本原理就是在此温度范围内维护器官，以尽量减少器官损伤。因此，NMP成为器官保存的新研究方向。

1 NMP的发展史

法国科学家卡雷尔最早于1930年进行NMP的研究，他在机械师C.A.林德伯格的协助下，设计了一个可以消毒的玻璃灌流器，将离体组织、器官，如肾脏、心脏、甲状腺等保存在灌流液中，不仅能存活，而且能够维持功能数日或数周［5］。但此后，由于技术的限制，NMP并未得到很大的发展。而近20年来，随着越来越多ECD的应用和体外膜式氧合器技术的发展，NMP得到了很大的发展［6-7］。

Brasile等［7］在1995-2010年发表了一系列关于犬类NMP的文章。灌注系统包括压力感受器、氧合器、搏动泵等，灌注温度采用32℃亚低温，灌注压控制为35 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），灌注液采用无细胞培养基［8-10］。2001 年，Brasile等［11］对5例弃肾进行NMP，供体经过长时间低温保存后，进行9小时NMP，结果所用肾脏功能均有所恢复，但仍未用于临床。

同期，研究人员在猪动物模型上利用另一套NMP系统，包括搏动泵、膜肺、静脉容器、热交换器［12］，肾脏灌注压设定为接近生理压力（75 mmHg），温度为36.8℃。灌注液以红细胞为基础，加入晶体液、 甘露醇、 前列腺素等，模拟人体内环境，2013年此系统应用于临床试验。

2 常温灌注机制

常温灌注是指以正常生理温度灌注器官。就器官保存而言，这显然是与临床移植开展以来，支撑器官冷保存的基本科学原理背道而驰［13］。NMP的原则就是尽量接近器官的生理环境，为器官的有氧代谢提供场所和介质，从而减少低温保存对代谢的不利影响。低温保存通过减少酶的生成来防止器官损伤，温度每降低10℃，代谢率降为原来的1/2～1/3，但同时缺氧环境也可导致器官损伤［14-15］，例如细胞内的pH值降低导致溶酶体不稳定。三磷酸腺苷（triphosadenine， ATP）的消耗使毒性代谢产物、腺苷酸、肌苷和次黄嘌呤蓄积。NA+/ K+-ATP泵失活，导致细胞内钙、钠、水蓄积。导致肾脏出现缺血/再灌注损伤，术后出现移植肾功能延迟恢复（delayed graft function， DGF）及原发无功［16］。NMP可以显著减少这些影响。

肾脏长时间NMP保存在技术上是可行的。Brasile等［17］的研究表明，NMP流速和氧代谢可维持超过48小时。而3小时的灌注足以改善肾脏的热缺血及冷缺血损伤［18］。Hosgood 等［19］采用类似策略，灌注时间减少到1小时，研究发现短暂NMP可上调保护性因子，如热休克蛋白（HSP）70和一氧化氮合酶的生产，同时可提高ATP含量，减轻细胞水肿，且可避免低温导致的肾脏损伤，减少肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、Caspas-3等炎症因子，恢复正常的细胞功能［20］。研究报道显示，NMP可将犬肾脏保存时间延长到6天，3天低温保存后进行3～4小时的NMP可补充ATP，此后再进行3天冷保存［21-23］。

3 灌注液

NMP为维持正常代谢功能需氧量和保存液中氧气溶解量，需要一个专门的氧载体。NMP灌注液可按成分分为含血液成分和不含血液成分的灌注液。大多数NMP研究中使用了血液作为氧载体。含血液成分灌注液存在一定缺陷，如长期灌注导致严重溶血、血小板激活、红细胞携氧能力下降等，此外，肾内高阻力及组织水肿也是一个重要问题［24］。随着搏动泵、体外循环技术的发展，压力和溶血的风险大大降低，而膜肺的应用提高了氧合效率［25］。与不含血液成分的灌注液相比，其更接近生理环境。Bagul等［20］建立了猪NMP模型，灌注液包括去白红细胞、晶体溶液、抗氧化剂及抗菌药物等。Hosgood等［26］首次将其应用于临床，灌注液为1个单位红细胞、晶体溶液及保护性添加剂，研究结果显示，18例ECD供肾术后DGF发生率仅为5.6%，远低于对照组的36%。

虽然血红蛋白可以有效给组织提供氧气，但也存在一些缺陷，如炎症损伤、氧自由基形成、补体激活、血栓形成等［24］。使得一些团队开始寻找其他替代的氧载体。1994年，Brasile等［9］首次采用不含血液成分的灌注液，以全氟化碳（PFC）作为携氧材料，包括细胞代谢所需的氨基酸、脂类及碳水化合物等。此后，Brasile等［11，27］通过一些列动物实验及弃肾灌注研究发现，PFC溶解氧气的能力较高，且稳定性较高。近期，研究发现，采用以新一代PFC为携氧材料的灌注液，可有效减少冷缺血及热缺血损伤，新一代PFC可成为未来NMP灌注液的发展方向［28］，但工艺复杂、费用昂贵限制其广泛应用。AQIX-RS-I作为一种非磷酸盐缓冲溶液，旨在为细胞提供常温环境下的代谢需求。

AQIX-RS-1的构成反映了生理所需的离子浓度、渗透性，维持细胞膜和酶的稳定性。AQIX-RS-1本身可以携氧，也可与红细胞混合。研究表明，采用AQIX-RS-I常温灌注可有效清除微循环中的代谢物，并为细胞提供足够的氧气支持［29-30］。其他天然存在的分子可作为氧载体、如Hemarina-M101，一种来自于海洋无脊椎动物（Nereididae蠕虫）的大血红蛋白分子［31］，Hemarina-M101在4～37℃均具有高度氧亲和力，有可能成为理想的常温灌注液。

4 NMP的临床应用

基于此前的实验研究，2011年，Hosgood等［32］首次报道NMP应用于临床，供体冷缺血时间为11小时，NMP 35分钟，术后早期肌酐下降缓慢但未行透析治疗，4年随访肾功能正常。2013年Hosgood等［26］再次报道了17例ECD供体NMP的临床研究，17例ECD供肾在移植前进行60分钟NMP，结果与47例常规冷保存供肾相比，NMP组DGF的发生率仅为6%（1/17），远低于对照组的36%（17/47），但两组在1年生存率上差异无统计学意义。2014年，此团队再次报道应用1对弃肾进行原位NMP，60分钟后双肾颜色好转，血流及尿量较前显著增加［33］。灌注后活检表现为急性肾小管损伤，肾小球正常，无肾皮质坏死。最终肾脏未进行移植，但这项研究证明NMP可能对缺血损伤较重的肾脏进行修复。

尽管，这些研究证实NMP是安全、可行的，且对边缘供体具有一定的修复作用，但其有效性仍需进一步研究。目前，一项多中心临床试验包含了400例心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death， DCD）的马氏3、4型肾移植患者，随机分为冷保存组及NMP组（冷保存+ 60分钟NMP），结果包括DGF发生率、肾功能变化、移植物存活率及急性排斥反应发生等。此实验更好地说明了NMP 的有效性［34］。

此外，NMP的另一个优势为可以在移植术前评估肾功能。即在患者接受ECD前，对器官功能的生物参数进行监测。目前，器官评估主要通过以下几方面：供体危险因素评估、供体切取前肾功能及尿量、病理活检等，供肾评估目前缺乏统一标准，主要依靠临床医生的主观判断。2012年，仅英国就有6%的脑死亡器官捐献（donation after brain death， DBD）供肾和17%的DCD供肾因无法判断质量而被弃用［35］。NMP让临床医生有一定程度的信心使用这些边缘供体，大大地提高了器官的利用率。2015年，Hosgood等［36］报道对74例不符合临床要求的肾脏进行60分钟NMP，根据灌注后肾脏外观、流速、尿量进行评分（1～5分，分值越高损伤越重），36例评分结果≤3分的肾脏进行移植，结果发现，评分为3分的供体术后DGF发生率（38%）显著高于1分（6%）和2分的供体（0%）。术后1年肌酐清除率与评分显著相关。

5 常温机械灌注的未来

目前，NMP技术已广泛应用于心脏、肺脏、肝脏移植，相比较肾移植研究偏少。NMP技术的另一项优势即为可以在移植术前对器官进行靶向性处理，而避免全身反应，如干细胞及基因治疗。

通过病毒转染基因，激活保护性旁路治疗急性、慢性排斥反应和缺血/再灌注损伤，一直是移植的热点研究方向，然而其毒性作用和免疫激活能力限制其直接应用于患者。而体外NMP能良好的避免这个问题，使肾脏作为唯一靶点。

Brasile等［37］的研究表明，NMP可以有效转染相关基因。在灌注过程中，加入编有报告基因的Ad5， CMV5 GFP重组腺病毒，通过24小时持续灌注，报告基因可定位于血管内膜。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，可以分化成多种功能细胞，可以用于组织修复和再生，医学界称为“万用细胞”［38］。在多个动模模型中，干细胞被证明可以修复急性肾损伤、改善肾脏功能、减少肾小管损伤、延长肾脏存活［39-41］。但目前仍难以靶向特定器官，而NMP可以完美解决这个问题。Brasile等［42］在猪热缺血模型和人弃肾NMP过程中，采用纤维母细胞生长因子1、2可有效诱导干细胞修复。

6 结 论

NMP模拟体内生理环境，维持有氧代谢，改变了低温保存的传统理论，在技术上安全可行。NMP正处在从实验向临床应用的过渡阶段，目前研究表明NMP相对于传统冷保存，具有很大优势：① NMP可以延长保存时间，并对供体进行修复；② 灌注期间，可以通过尿量、流速、阻力指数及肾脏损伤标记物对肾脏进行评估，减少器官丢弃，提高肾脏利用率；③ 灌注期间可以结合基因治疗及干细胞治疗，在移植术前对器官进行靶向性处理。总之，NMP目前已成为器官保存技术的重要研究方向。