胰腺和胰岛的保存在胰岛移植中的研究进展

谢艳,王树森（天津市第一中心医院移植中心，卫生部危重病急救医学重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 300192）

1 型糖尿病是器官特异性自身免疫性疾病［1］，胰岛移植用于治疗1型糖尿病已经受到广泛关注，也取得了一定的临床效果［2-5］。国际胰岛移植登记处的数据显示，移植后胰岛素撤离比例从1999-2002年的27%升高到2007-2010年的44%，总体来说，2007-2010年患者胰岛移植的效果较1999-2006年有所提高［6］。临床研究表明，胰岛移植后5年仍然不依赖胰岛素治疗的患者比例可达60%［7］。目前，胰岛移植面临的问题之一是优质供体胰腺短缺，尤其是胰腺用于胰岛制备前的保存以及胰岛培养是影响胰岛移植疗效的重要因素。因此，如何防止保存期间胰腺损伤和胰岛功能下降也成为研究热点，本文对胰腺和胰岛的保存在胰岛移植中的研究进展进行简要综述。

1 胰腺的保存

胰岛是利用供体胰腺，通过胶原酶消化、纯化等过程制备而来的，胰岛制备前需要高质量保存供体胰腺。

1.1 胰腺静态低温保存及保存液：无论供体胰腺用于胰腺移植还是分离提纯后进行胰岛细胞移植，其保存方法主要是静态低温保存［8］。低温（2～4℃）保存可以通过降低细胞代谢率、减少氧耗量和三磷酸腺苷（triphosadenine， ATP）的使用来减少缺血损伤［9］。保存液有利于减少低温带来的不利影响。常用的保存液主要包括UW液、HTK液和Celsior液。其中UW液目前是静态低温保存（static cold storage， SCS）公认的保存液［8-10］，广泛应用于胰岛分离前胰腺的获取和保存［11］。但UW液的缺点是使用之前必须冷藏，其高黏特性可以导致胰腺冲洗和灌注不充分［12］。另有研究报道显示，UW液会抑制消化过程中胶原酶作用而导致胰岛产量和功能下降［13］。HTK液具有低黏性，并且价格相对低廉，最初作为心脏停搏液，之后频繁用于心脏、肾脏和肝移植中。有研究证实，UW液与HTK液在动物模型和临床胰腺保存中具有相似结果［14］。另一项研究报道表明，若冷缺血时间＜10小时，与UW液相比，HTK液保存用于胰岛分离的胰腺效果类似，但是当延长低温保存时间后，胰岛的产量有所下降［15］。Celsior液是一种细胞外胶体溶液，早期的临床研究显示，UW液与Celsior液用于肺、肝及肾的保存没有明显差异［16-18］。但 Hubert等［19］报道了 Celsior液用于人和猪胰岛分离前供体原位灌注，研究结果显示，UW液原位灌注优于Celsior液，原因之一是Celsior液仅在冷藏后4小时就会导致细胞肿胀及胰腺水肿。

1.2 双层保存法：1988年，Kuroda等［20］发明了双层法保存胰腺，双层法含有UW液和全氟化合物，胰腺悬浮在两层不相融的液体之间。全氟化合物具有亲脂性，且氧气在其中的溶解系数很高，氧气能持续不断地供给胰腺。供体胰腺运输途中面临缺血和缺氧这两个严重影响胰岛分离和移植效果的因素［21］。双层法可以为保存的胰腺提供氧气，显著提高冷缺血时间较长的胰腺及边缘供体的利用率［22］。对于胰岛分离前的胰腺保存，双层保存法是否优于单纯UW液保存一直存在争议。一篇纳入14篇文章包含18项临床研究的Meta分析显示，与单独使用UW液相比，单独双层保存能得到更高的胰岛IEQ和更高的移植率，但胰岛活性、纯度和葡萄糖刺激指数（glucose stimulation index， GSI）无明显差别［23］。

1.3 胰腺机械灌注保存：SCS花费较少且易于实施，但也有局限性。低温虽然降低了代谢活性，却不能完全停止代谢活动，无氧代谢也会持续产生细胞内毒素并积累代谢产物［24］。由于是静态保存，胰腺内代谢毒素不能被清除，ATP持续被消耗，乳酸积累都会导致缺血损伤。另外，低温保存也可能造成胰腺直接冻伤［25］。胰腺体外机械灌注在一定程度上可以弥补上述不足，并且具有如下优势：① 实现氧气和营养物质循环，持续提供氧气和营养物质以维持胰岛细胞代谢。② 清除代谢产物和毒素，这对边缘供体尤其重要，因为公民逝世后器官捐献（donation after citizen's death， DCD）器官已经积累了许多代谢产物和促炎介质。机械灌注将这些毒物清除，可以有效提高移植物功能且减少并发症［26-29］。③ 保护血管和内皮，流体通过微血管时维持血管床有利于内皮基因和功能的表达［30-31］。④ 有利于供体活性评估，目前，灌注时血管抵抗已经成为一个关键的活性评估指标［32-33］。⑤ 实施治疗与基因治疗，通过加入治疗性药物甚至通过基因修饰来改善保存的器官。多种添加剂在动物和临床实验中都被证实可以减少或修复缺血/再灌注损伤，包括P52抑制剂pifithrin-alpha（抗凋亡制剂）、钙通道阻断剂、拉扎洛依（离子介导的脂质过氧化抑制剂）、过氧化物歧化酶（自由基酶清除剂）、别嘌醇和血红素氧化酶 （热休克蛋白）［24，34］。此外，通过基因修饰可以减轻缺血/再灌注损伤以及调节宿主免疫反应。基因转染通常需要长时间器官灌注确保转染有效，并且在正常生理性代谢的基础上基因转染才更加有效，这正是常温下机械灌注的优势［24，34］。⑥ 远程共享和择期手术，机械灌注能延长保存时间，实现器官远程分享，使手术得以更加有计划地进行，有利于提高总体生存率及降低费用［35］。

2 胰岛的保存

Edmonton方案最初要求胰岛分离后4小时之内移植到受者体内［36-37］。如果移植前将胰岛进行培养，不仅可以完善胰岛的质控，还可对受者进行免疫诱导，且在受者到达诊疗中心之前保护好胰岛。而多项研究表明，胰岛培养和保存时质量和数量都会急剧下降［38-41］。移植中心对胰岛移植前胰腺和胰岛的保存方法仍需进行探索，完善培养和保存方案，以进一步提高胰岛移植临床效果。

2.1 胰岛培养温度：研究显示，在相对较低的温度条件下培养胰岛，可以有效提高用于移植的胰岛保存质量。Brandhorst等［42］研究发现，22℃培养可以改善猪胰岛的存活，但与37℃相比，22℃培养会减少24小时胰岛素释放量。研究显示，在37℃培养时胰岛中间坏死情况较为严重，而22～26℃培养能显著减少胰岛中间区域坏死的发生［42-43］。Itoh 等［44］也发现在低氧条件下（1% O2，5% CO2，94% N2），37℃时细胞死亡率比22℃时高。Ono等［45］的研究显示，与维持在37℃培养相比，将温度从24℃提高到37℃（24℃培养1～4周后升温到37℃培养1周）能增加胰岛细胞胰岛素释放率。这些研究结果均提示胰岛培养温度22～26℃可能优于37℃。进而Ikemoto等［46］研究发现，4℃条件下猪胰岛的复苏率明显高于37℃和22℃。Ishii等［47］报道了4℃ UW液中保存胰岛，其数量几乎与新鲜胰岛一致。Itoh等［44］显示低氧条件下（1% O2， 5% CO2， 94% N2），4℃条件下培养时细胞死亡率明显低于37℃；链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠接受4℃低氧培养的胰岛移植后糖尿病症状得到明显改善，但接受22℃和37℃低氧培养的胰岛效果却治疗效果欠佳。Noguchi等［48］和Kin等［40］都发现与新鲜的胰岛相比，22℃和37℃培养后胰岛直径更小，但4℃培养后，胰岛直径和形态、腺泡细胞形态都与正常胰岛一致。研究显示，4℃培养时需氧量低，且低温可以抑制细胞因子/趋化因子的活性，这些可能是4℃条件下培养胰岛更具活性的原因［43，45］。因此，后续的研究应该详尽评估胰岛4℃保存时对胰岛的保护作用以及用于移植后的临床疗效。

2.2 培养液中人血清白蛋白 （human serum albumin，HSA）的添加：Connaught Medical Research Laboratories（CMRL）发明的含0.500%～0.625% HSA培养基已被很多移植中心用于临床移植胰岛的培养［38，48］。通常认为添加血清的培养基比单独添加HSA的培养基更好，因为血清中可能含有利于胰岛活性的成分，而且能够中和内源性胰酶和分离过程中遗留的外源酶［49-50］。当用10%的人AB型血清替代0.625%HSA时，胰岛凋亡水平更低，刺激后胰岛素分泌水平更高。Kerr-Conte等［51］研究发现，用2.5%人AB型血清替代0.625% HSA培养胰岛时，胰岛活性更高，胰岛素含量更多，且胰岛刺激指数更高。Avgoustiniatos等［52］发现，使用胎牛血清做添加物比用HSA做添加物时，单位DNA平均耗氧率高27%。但是，胎牛血清作为添加物并不理想，因为可能会引入异种遗传物质而产生异种排斥反应。而获取大量AB型血清用于临床胰岛分离和培养也较难。因此，许多移植中心仍然用HSA作为临床胰岛培养基的添加剂。

近几年，临床胰岛移植取得了长足的进展，逐渐成为脆性糖尿病和移植后严重糖尿病患者的理想治疗手段。提高供体胰腺的保存质量用于胰岛制备以及提高移植前胰岛培养的效果，势必将进一步提高临床胰岛移植的疗效以及扩展临床胰岛移植的应用范围。