经典型霍奇金淋巴瘤表观遗传学异常及其对免疫逃逸的影响

刘晓健 龙志国 综述 乔忠杰 审校

经典型霍奇金淋巴瘤表观遗传学异常及其对免疫逃逸的影响

刘晓健1龙志国2综述 乔忠杰3审校

经典型霍奇金淋巴瘤(Classic Hodgkin lymphoma，cHL)恶性表型的维持和表观遗传学有一定关系，表观遗传学改变主要包括组蛋白乙酰化异常和DNA甲基化异常，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylases inhibitors，HDACis)的临床研究取得了进展。表观遗传学异常和cHL的免疫逃逸密切相关，甲基转移酶抑制剂、HDACis和免疫检测点阻断剂具有协同作用，采用联合治疗策略对进一步提高cHL的治愈率有重大意义。

经典型霍奇金淋巴瘤；甲基化；乙酰化；免疫逃逸；免疫检测点抑制剂

霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)分为经典型霍奇金淋巴瘤(classic HL，cHL)和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(Nodular Lymphocyte-Predominant HL，NLPHL)，其中cHL的发病率占HL的95%以上[1]。cHL的肿瘤细胞称为霍奇金-李-斯细胞(Hodgkin-Reed-Steinberg，HRS)，显微镜下，HRS细胞数量很少，而周围T淋巴细胞、非肿瘤性B淋巴细胞、粒细胞和基质细胞数量占绝大多数，构成cHL独特的病理学特征。cHL的HRS细胞起源于生发中心B细胞，但不表达细胞膜B细胞标志，这种特殊现象与cHL存在表观遗传学异常密切相关。表观遗传学异常也是造成cHL免疫逃逸的重要原因。阐明免疫逃避的表观遗传学机制，对进一步提高cHL的疗效有重要意义。

1 cHL表观遗传学异常

cHL维持恶性表型是通过传统的遗传学和表观遗传学改变获得的。传统的遗传学研究表明，15%cHL的HRS细胞中编码IκBα(Inhibitor kappaB alpha)的NFKBIA基因发生突变，约40%的HRS细胞EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)LMP-1表达增高，NF-κB亚单位REL基因的突变和扩增，以及发现绝大多数cHL微环境中CD40L和HRS细胞膜CD40的活跃反应，这些遗传改变造成核因子-kappaB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)异常活化[2]。虽然近年细胞和分子遗传学技术快速发展，但是仍然未发现cHL有特定的致癌驱动基因异常。

HRS细胞基因组具有和正常B细胞一样的基因重排，但细胞膜表达的B细胞标志下调，由此确认cHL是来源于B淋巴细胞的恶性肿瘤，也认识到表观遗传学异常改变可能是B细胞标志表达丢失的原因[3]。

1.1 cHL中甲基化异常

DNA甲基化是最早发现的一种表观遗传学改变，它能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能。DNA甲基化主要发生在一些基因序列的启动子富含CpG二核苷酸的区域，称为CpG岛。人类50%～60%左右的基因启动子区都含有CpG岛，它们的甲基化状态影响基因的转录和表达，在胚胎发育和细胞分化过程中扮演重要作用。肿瘤发生中，抑癌基因CpG岛中的CpG位点呈高度甲基化状态，从而造成染色体结构的改变而使基因表达沉默[4]。

Siebert等[5]分别对cHL和正常B淋巴细胞的13088个基因中的24312个CpG岛甲基化进行了分析[5]，和正常B淋巴细胞相比，cHL中383个CpG岛甲基化明显增高，其中常见的基因CD79β、BOB1和SYK启动子的CpG岛高甲基化，HRS细胞失去B细胞表型可能和这些基因甲基化造成的基因沉默有关。与基因突变不同的是，恶性肿瘤中DNA的异常甲基化等表观遗传学事件有一定的可逆性，在肿瘤或者癌前病变中通过去甲基化的处理可以恢复某些关键性抑癌基因的功能，从而起到预防和治疗肿瘤的目的。阿扎胞苷和地西他滨是DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑制剂，美国FDA批准阿扎胞苷和地西他滨用于骨髓异常增生症等淋巴造血系统肿瘤[6]。

1.2 cHL中组蛋白乙酰化异常

真核细胞的DNA复制和转录依赖于组蛋白-DNA复合物的空间结构改变，细胞行使生理功能有赖于组蛋白乙酰化酶(Histone acetylases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)作用的平衡性和可逆性，肿瘤细胞的表观遗传学改变打破了这种平衡，并可在子代细胞中表现出来。HATs和HDACs对一些非组蛋白细胞蛋白如HSP90、HIF-1和p53蛋白等也存在修饰作用，乙酰化其中的赖氨酸残基可增加它们的稳定性，而去乙酰化暴露赖氨酸残基，有利于泛素化，造成蛋白质降解，从而调节细胞的功能[7]。

1.2.1 cHL中HATS的研究 目前HATs共有5个家族17个成员，GNAT家族包括GCN5、HAT1、PCAF和ATF24个成员；CBP/p300家族包括CBP和p300；MYST家族包括TIP60、MOZ、MORF、HBO1和MOF；类固醇受体共活化分子(SRCs)家族包括NCOA1、NCOA2和NCOA3；其他HATs包括TAF1(TAFII250)、CLOCK和TFIIIC。每种HATs包含催化亚单位和蛋白-蛋白识别亚单位，承担催化组蛋白和/或DNA的乙酰化反应[8]。

cHL中HATs的CBP存在突变，多数为无义突变和/或缺失突变，cHL中p300存在错义突变，这些突变在cHL的意义有待阐明[9]。理论上HATs突变影响了HATs的功能，促进肿瘤细胞的生长[10]，HATs的抑制剂(HATs inhibitors，HATis)有合成化合物、天然植物和及其提取物。一些初步的研究显示p300、PCAF和TIP60的抑制物漆树酸、没食子酸和姜黄素对一些淋巴瘤细胞株的生长有抑制作用，不过其机制不清[11]。目前还没有HATis获得FDA批准。

1.2.2 cHL中HDACs研究 HDACs共有4类18种，I类包括HDAC1、2、3和8，II类为HDAC4、5、6、7、9和10，Ⅲ类为SIRT1-7以及Ⅳ类HDAC11，除Ⅲ类为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)依赖型，其他HDACs为锌指依赖型。cHL中HDACs常常过表达，但很少发生基因突变。在cHL细胞株和组织中，和β-actin相比，HDAC1、2、3和8明显过表达，其中，HDAC3过表达程度较轻。HDAC4过表达，HDAC5、7、9和10有不同程度的表达。除了cHL的HD-LM2细胞株中HDAC6高表达，HDAC6在其他cHL细胞株和组织中低表达或不表达。HDAC11在cHL细胞株表达，在cHL组织标本中表达很弱或不表达[12]。

按照HDACis的分子结构和作用不同，HDACis可分为异羟肟酸类，包括vorinostat、givinostat、abexinostat、panobinostat、belinostat、rocilinostat和trichostatin A；环状四肽类，包括romidepsin和trapoxin；苯甲酸酰胺类，包括entinostat和mocetinostat以及酮体和脂肪酸类，包括丙戊酸和丁酸[13]。

和HATis的研究相比，HDACis的临床研究取得了很大进展。美国FDA分别于2006年和2009年批准vorinostat和romidepsin用于原发于皮肤的T细胞性淋巴瘤的二线治疗，2014和2015年分别批准belinostat和panolbinostat用于复发耐药的外周T细胞性淋巴瘤(PTCLs)和多发性骨髓瘤。复发的cHL在大剂量化疗和外周血造血干细胞移植后如果再次复发，目前还没有标准的治疗方法。针对这部分复发难治的cHL进行的II期临床研究显示，广谱HDACis panolbinostat仍然能够获得27%的客观有效率，中位缓解期达6.1个月[14]。I类选择性HDACis MGCD0103也获得25%的客观有效率，中位PFS达到9个月[15]。可见，无论广谱和特异性的HDACis在复发难治的cHL中仍可取得一定的肿瘤缓解率和很好的PFS。而新一代的选择性HDACis的研发，免疫检测点通路抑制剂联合治疗的研究将进一步提高cHL患者的疗效。

2 cHL中HRS细胞的免疫逃逸机制探讨

HRS细胞在cHL中数量很少，而T细胞、非肿瘤性B细胞、粒细胞和基质细胞数量却占绝大多数，但是HRS细胞却成功地逃避免疫攻击，这种免疫逃避的机制十分复杂，有待进一步研究。从HRS细胞本身来说，首先由于HRS细胞基因突变所累积的抗原本身比较微弱；其次HRS细胞MHC-I、MHC-II表达降低或缺失，这些分子是免疫应答过程中T细胞受体识别所必须的；第三HRS细胞中程序死亡受体1配体(Programmed death-1 ligands，PD-L1，CD274)表达增高；最后HRS细胞能分泌IL-10、TGF-β和IL-35等细胞因子抑制免疫细胞的功能[16]。从免疫系统方面来说，首先HRS细胞分泌的抑制免疫功能的细胞因子、HRS细胞表达的PD-L1和这些CD4+T细胞表达的PD-1结合等，都可促使CD4+的T细胞向调控T细胞(Regulatory T cells，Treg)方向转化[17]；其次CD4+T细胞识别MHC-II限制的肿瘤抗原，但是抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells，APCs)MHC-II的表达也受到Treg的抑制；最后Treg细胞也能产生大量免疫抑制性细胞因子IL-10、细胞毒性T细胞抑制性受体相关蛋白4(Cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA4)和程序死亡受体1(Programmed death-1，PD-1，CD279)，抑制肿瘤免疫功能。

实体瘤微环境中的浸润淋巴细胞主要是CD8+T细胞，识别由肿瘤细胞MHC-I递呈的抗原。cHL的肿瘤细胞起源于B淋巴细胞，微环境中行使肿瘤免疫攻击的主要为CD4+T细胞，能识别cHL的肿瘤细胞和APCs上MHC-Ⅱ递呈的抗原，但是如上所述，HRS细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达降低或缺失，导致CD4+T细胞无法识别通过MHC-II递呈的抗原。Treg对免疫功能多方面的抑制和PD-L1/PD-1通路的启动等，都是HRS细胞免疫逃逸的重要原因。

3 cHL中HRS细胞表观遗传学异常对免疫逃逸的影响

cHL中HRS细胞膜上MHC-Ⅱ的表达受到MHC-II反式激活分子(MHC class II transactivator，CIITA)的控制[18]，而CIITA启动子的高甲基化和低乙酰化，造成CIITA表达减少[19]。如果用甲基化酶抑制剂EZH2可以逆转这种情况，表现为升高HRS细胞MHC-II的表达。

PD-L1基因位于染色体9p24.1，研究显示在结节性淋巴细胞为主性cHL中超过90%的患者的存在该部位的扩增[20]，在白血病中的研究认为这和PD-L1启动子甲基化状态有关[21]。cHL中HRS细胞PD-L1蛋白表达明显增高，JAK3促进AP1等转录因子作用于PD-L1启动子区域，促进了PD-L1表达[22]。有趣的是JAK3的基因也存在于9p24.1中26。

HDACs上调CD4+T淋巴细胞FoxP3表达促进Tregs形成[23]，而HDACis下调CD4+T淋巴细胞FoxP3表达，抑制Tregs的活性，从而活化CD4+T效应细胞。

4 DNMT抑制剂、HDACis和免疫检测点阻断治疗的协同作用

最新的临床研究初步证实PD-1抑制剂大大提高了cHL患者的临床缓解率。Ansell等[24]入组23例复发耐药的cHL患者，这些患者曾接受过多疗程化疗、Brentuzumab和自体造血干细胞移植。接受Nivolumab有效率高达87%，完全缓解率达到17%，24周PFS为86%，目前正进行扩大规模的II期临床研究。另一项临床研究结果同样令人鼓舞，29例患者接受pembrolizumab(MK-3475)，有效率达到66%，完全缓解率达到21%，89%的患者持续缓解中[25]。

PD-L1/PD-1抑制剂在cHL中令人瞩目的疗效得到证实之前，无论广谱和特异性的HDACis都取得一定的肿瘤缓解率和很好的PFS水平[26]，目前虽然HDACis单药有效率远不如PD-1抑制剂，但是HDACis的24周PFS也超过了70%，这显示HDACis除了直接杀灭肿瘤细胞作用以外，还可能对免疫功能、肿瘤微环境有一定的影响[27]。近年来，研究者证实HDACis的疗效依赖HRS细胞周围T细胞的免疫功能[28]，HDACis可以直接下调CD4+T淋巴细胞的PD-1表达，达到阻断PD-L1/PD-1通路的效果[27]，从而增加T细胞免疫功能。这些研究提示HDACis和免疫检测点阻断治疗可能有协同作用[29-31]。

5 小结与展望

cHL存在组蛋白乙酰化异常和DNA甲基化异常，这些表观遗传学异常和cHL的免疫逃逸密切相关，甲基化酶抑制剂、HDACis和免疫检测点阻断剂具有协同作用。目前的临床研究显示HDACis在cHL中取得良好的结果，近年针对cHL采用PD-1/PD-L1抑制剂取得更理想的效果，联合HDACis和PD-1/PD-L1抑制剂的治疗策略可以进一步提高疗效，还能降低用药剂量，从而减少治疗相关的毒副作用，对根本解决cHL的治疗问题有重大意义。

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(收稿：2016-10-08)

Research progress in epigenetic aberrant in classic Hodgkin lymphoma

LIUXiaojian1，LONGZhiguo2，QIAOZhongjie3

1.Department of Medical Oncology，Fudan University Shanghai Cancer Center，Department of Oncology，Shanghai Medical Collage，Fudan University，Shanghai 200032，China；2.Department of Medical Oncology，Fudan University Pudong Hospital，Fudan University；3.Department of Urology，The Affiliated Cancer Hospital of Harbin Medical University

The malignant phenotype of classical Hodgkin lymphoma(cHL)is partly maintained by epigenetic aberrant，of which consisted mainly abnormal histone methylation and deacetylation.Progress has been made in clinical trials related to the histone deacetylases inhibitors(HDACis)in cHL.There is a close association noted between the epigenetic aberrants and the immune escape in cHL.DNA methyltransferase(DNMT)inhibitors，HDACis and immune checkpoint blockade have shown synergistic effects.Further study to improve the cure rate in cHL by combination strategy is of significant importance.

Classical Hodgkin lymphoma；Methylation；Acetylation；Immune escape；Immune checkpoint inhibitor

1.复旦大学上海肿瘤中心肿瘤内科，复旦大学上海医学院肿瘤学系(上海 200032)；2.复旦大学附属浦东医院；3.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科

刘晓健，男，(1968-)，博士，副主任医师，从事肿瘤的表观遗传学方向的研究

刘晓健，E-mail：lxj068@hotmail.com

R730.5

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.016