不对称PCR扩增检测土壤中的肠道病原菌

刘燕++孙学明++邹晓琳

摘 要：主要研究内容为通过对最佳反应总体系、反应时间和反应温度等条件进行探索，建立用不对称PCR扩增技术检测土壤中典型肠道病原菌的实验条件。实验主要目的是通过不对称PCR扩增技术获得大量的单链DNA，为用基因芯片方法检测土壤中的典型肠道病原菌做准备。应用不对称PCR扩增检测技术对样品进行荧光标记后，与寡核苷酸基因芯片进行杂交，可以提高杂交效率。

关键词：不对称PCR 土壤 典型病原菌

中图分类号：X17 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2016）11（b）-0062-02

不对称PCR是指反应体系中两条浓度不一样的引物，在PCR扩增的后期，当其中量少的一条引物被消耗完以后，另一条继续以线性扩增的方式，产生大量的扩增产物单链 DNA。部队称PCR扩增检测技术可以应用的范围相对较为广泛：如配合RT-PCR扩增技术研究真核DNA外显子、制备单链探针、DNA序列分析等，在寡核苷酸基因芯片的检测应用方面，不对称PCR在标记单链样品方面比常规PCR更有优势，与寡核苷酸芯片杂交效率也较高。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

研磨过筛（20目），-80 °C保存备用。

1.2 主要试剂及试剂盒

主要试剂及试剂盒：引物、dNTP、50 bp DNA Ladder，100 bp DNA Ladder、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。

1.3 主要仪器

凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），PTC-100 PCR仪（MJ Research，Waltham，MA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪（Biospec products，USA），DYY-8B型电泳仪（北京市六一仪器厂）FastPrepTM FP120核酸提取仪（Bio 101，Carlsbad，USA），高速离心机（上海安亭）。

1.4 DNA提取

利用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒与Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪提取土壤DNA。主要过程参见FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒。

1.5 引物合成

参照文献[1-2]合成引物：UP1：GAAGTCATCATGACCGT

TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，P2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRT

CNGTCAT（R指的是A或者G，Y指的是C或者T，N代表任何碱基）。

1.6 PCR产物电泳检测

0.5×TBE缓冲液，6×上样缓冲溶液，1%（w/v）琼脂糖凝胶，200 V恒压，电泳25～35 min。

2 结果与分析

引物的浓度比up1∶up2r依次为：1∶1、5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、75∶1和100∶1。从图1可以看出：当引物浓度比为5∶1时产生的单链扩增产物条带比较微弱，随着下游引物的浓度（10∶1、25∶1和50∶1）进一步减小，有较多的单链DNA条带产生。

以上述PCR扩增产物1～7为模板，进行新一轮的PCR扩增，以获得更多的单链DNA扩增产物。从图2中可以看出：泳道1～3无任何的双链DNA条带产生，泳道4有微弱的单链DNA扩增产物条带产生，泳道5～6有大量的單链DNA条带产生，泳道7扩增产物条带则开始减弱直至消失。主要原因是不对称PCR线性扩增阶段是在前半程扩增所产生的双链产物的基础上进行的，双链产物的量过少易导致最终生成的单链产物也较少[3]，且指数扩增阶段太短。

3 结语

土壤中具有代表性的肠道病原菌用不对称PCR扩增技术检测的最佳反应条件经验证为：总体系25 μL，其中10×PCR 缓冲液2.5 μL，25 mmol/L Mg2+1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，引物UP1∶UP2r为50∶1或75∶1，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O补足体系。最佳PCR反应参数为95 ℃，5 min（95 ℃，1 min；68.4℃，1 min；72℃，2 min）35轮循环，72 ℃，10 min。

参考文献

[1]Gyllensten U B，Erlich H A.Nationl Instistutes of Health[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（20）：7652-7656.

[2]Tankouo-Sandjong B，A Sessitsh，E Liebana，et al.MLST-v，multilocus sequence typing based on virulence genes，for molecular typing of Salmonella enterica subsp.enterica serovars[J].Journal of Microbiological Methods，2007（69）：23-36.

[3]孔德明，蒋海燕，沈含煦，等.分子信标用于不对称PCR检测乙型肝炎病毒[J].分析测试学报，2005，24（2）：7-10.