益气滋阴方对免疫性血小板减少症患者外周血Treg及Foxp3影响的临床观察

张宇 钱丽丽 陈颖 高雁婷 陈均法 沈建平 周郁鸿

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 31006

益气滋阴方对免疫性血小板减少症患者外周血Treg及Foxp3影响的临床观察

张宇 钱丽丽 陈颖 高雁婷 陈均法 沈建平 周郁鸿

浙江中医药大学附属第一医院 杭州 31006

[目的]探索益气滋阴方治疗免疫性血小板减少症的疗效及其具体机制。[方法]选取112例免疫性血小板减少症患者，随机分为对照组（常规西医治疗）和治疗组（益气滋阴方+常规西医治疗）各56例，同时设正常对照组56例。治疗前后检测血小板计数评价总体疗效，取外周血单个核细胞检测Treg百分率及Foxp3 mRNA表达水平。[结果]治疗组总有效例数47例（83.92%），明显高于对照组的38例（67.86%，P=0.047）。治疗组治疗后Treg比例及Foxp3mRNA表达水平较治疗前、对照组治疗后均明显升高（P＜0.001）；对照组治疗后Treg比例及Foxp3mRNA较治疗前均无明显差异（P=0.055，0.058）；治疗组治疗后Treg比例及Foxp3mRNA与正常对照组比较仍偏低且有统计学差异（P＜0.001）。[结论]益气滋阴方能促进Foxp3表达并诱导Treg生成，进而通过恢复免疫平衡状态来治疗免疫性血小板减少症。

免疫性血小板减少症；Treg；Foxp3；益气滋阴方

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是临床常见血液病，主要病机是免疫系统过度激活后破坏血小板，易复发并成为难治[1]。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）能发挥免疫耐受和免疫平衡的作用，其数量减少和功能受损与ITP发病成正相关[2]，转录因子“叉状头蛋白p3”（forkhead box p3，Foxp3）是Treg的关键转录因子。本病中医多责之“气阴”，笔者以此为基础创立的益气滋阴方，临床疗效显著[3]，今予此方治疗ITP患者，观察总体疗效、外周血Treg以及Foxp3mRNA的变化，以阐明此方发挥作用的具体机制。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参照文献标准[4]：多次检查血小板计数减少；骨髓检查巨核细胞数增多或正常，有成熟障碍；排除其他继发性血小板减少症。

1.1.2 中医辨证诊断标准 参照文献标准[5]：主症，神疲乏力，头晕目眩，心悸气短，手足心热，口干心烦；次症，瘀点瘀斑、色淡或红，久病不愈，食欲不振，目眩耳鸣，潮热盗汗、颧红，过劳则加重，胃纳欠佳，舌质淡红、苔少或薄白，脉细。主症必备，次症具其中2项及2项以上，结合舌、脉象即可诊断。

1.2 一般资料 选取浙江中医药大学附属第一医院2012年4月至2016年9月确诊为ITP病例112例，同时符合西医诊断和中医证候辨证标准；年龄在12～80岁；自愿参加本试验并签署临床研究知情同意书。采用数字表随机纳入治疗组及对照组各56例。治疗组男33例，女23例；年龄12～77岁，中位年龄39岁。对照组男29例，女27例；年龄13～77岁，中位年龄41岁。同时设正常对照组56例，标本均来自健康体检者。三组资料比较，在年龄、性别等方面的差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 使用西医常规治疗。一线治疗：（1）肾上腺糖皮质激素：泼尼松口服1.0mg/kg/d，严重者可用等效剂量地塞米松、甲泼尼龙等。病情稳定后快速减量(＜15mg/d)，如不能维持则考虑二线治疗。（2）静脉输注丙种球蛋白：400mg/kg/d*5d或 1.0g/kg/ d*1d(严重者连用2d)，必要时可以重复。二线治疗：包括脾切除、硫唑嘌呤、CD20单抗、TOP激动剂等。

1.3.2 治疗组在 对照组治疗基础上加用益气滋阴方。组成：黄芪30g，鳖甲15g，太子参20g，山海螺30g，紫草9g，茜草9g，干芦根15g，申骨粉4.5g。每日1剂，分两次煎服。服用1月为1疗程，3个疗程后进行评价。

1.4 疗效评价 疗效评价参照文献[4]：显效，血小板计数＞100×109/L，出血症状停止，并维持2周以上；有效，血小板计数＞50×109/L或较前上升30×109/L以上，出血症状停止，并维持2周以上；进步，血小板计数上升，出血症状改善，并维持2周以上；无效，血小板计数及出血现象无改善。总有效率=(显效+有效+进步）/总例数。

1.5 指标检测

1.5.1 外周血血小板计数 清晨静息状态下取患者外周血2～3mL于EDTA抗凝试管中，以SF-3000型全自动五分类血球分析仪进行分析。

1.5.2 Treg百分率检测 清晨取研究对象肝素抗凝静脉血5mL，常规分离单个核细胞（PBMC），含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞至1×106/mL，取200μL加入单克隆抗体（Becton,Dickinson and Company,美国）标记的PC5-CD4、FITC-CD25、PE-CD127，设同型对照管，4℃避光孵育30分钟后上流式细胞仪检测,圈定CD4+CD25+CD127low细胞为Treg。

1.5.3 Foxp3 mRNA表达水平检测 取3×106PBMC，Trizol提取总RNA，定量后取1μgRNA，逆转录后取cDNA4μl进行PCR。PCR反应条件均为94℃变性40s、60℃退火40s、72℃延伸60s,35个循环。产物2%琼脂糖电泳,凝胶成像系统扫描。Foxp3 mRNA表达水平以Foxp3/β-actin表达。

Foxp3：

上游5′-AGGCTTCATCTGTGGCATCAT-3′

下游5′-CTTGCGGAACTCCAGCTCAT-3′

β-actin（内参）：

上游5′-ATGGATGATGATATCGCGCG-3′下游5′-CATGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC-3′

1.6 统计学方法 采用SPSS15.0进行统计分析。正态数据指标以±s表示，总体疗效进行Pearson卡方检验，计量资料两两比较采用配对或成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总体疗效评价 两组患者在治疗3个月后进行疗效评价，治疗组总有效例数为47例（83.92%），对照组的总有效例数为38例（67.86%），两者比较有统计学差异（P=0.047）。见表1。

2.2 Treg百分率的变化 治疗组经益气滋阴方干预后PBMC中Treg百分率较治疗前明显上升（4.63± 0.39VS0.58±0.07，P＜0.001），且明显高于对照组治疗后（4.63±0.39VS1.30±0.16，P＜0.001），但与正常对照组比较仍偏低且有统计学差异（4.63±0.39VS6.35±0.93，P＜0.001），对照组治疗前后Treg百分率变化无统计学差异（0.57±0.07VS1.30±0.16，P=0.055）。见图1。

2.3 Foxp3 mRNA表达水平的变化 治疗组经益气滋阴方干预后PBMC中Foxp3 mRNA表达水平较治疗前明显上升（1.13±0.10VS0.39±0.10，P＜0.001）,且明显高于对照组治疗后（1.13±0.10VS0.72±0.23，P＜0.001），但与正常对照组比较仍偏低且有统计学差异（1.13±0.10VS1.46±0.17，P＜0.001），对照组治疗前后Foxp3 mRNA表达水平无统计学差异（0.48±0.12VS0.72±0.23， P=0.058）。见图2。

表1 两组患者治疗后总体疗效评价[例（%）]

3 讨论

图1 三组间PBMC中Treg百分率的变化（%）注：Treg百分率的变化在治疗组治疗后与治疗前、对照组治疗后、正常组行配对或成组t检验，均为**P＜0.001。

图2 三组间PBMC中Foxp3 mRNA表达水平变化注：Foxp3 mRNA表达水平的变化在治疗组治疗后与治疗前、对照组治疗后、正常组行配对或成组t检验，均为**P＜0.001。

ITP是临床最为常见的出血性疾病。经典理论认为该病的发生是由于机体产生了特异性自身抗体，导致血小板被单核巨噬细胞或免疫系统过渡破坏。现代研究证实除了体液免疫紊乱外，细胞免疫失衡也在本病发展中起到重要作用[2]。Treg作为T细胞中独特的亚群，主要起免疫耐受和免疫抑制的作用。其数量减少和功能受损后，抑制功能减弱导致自身反应性T细胞增殖活性提高；分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子水平降低导致B细胞增殖产生大量抗血小板抗体[6]，最终导致本病发生。Treg数量减少和功能受损已被证实和ITP发病成正相关[7]。因此，寻找促进Treg数量及功能恢复的方法是目前临床研究的热点与难点。Treg的特异性标志是转录因子Foxp3，其在细胞内的稳定表达是Treg分化完成的标志[8]。

ITP属中医学“血症”、“发斑”等范畴，其主要病机为火热熏灼或气虚不摄，致使血液不循常道溢出而发病。本病多责之“气阴”：久病自虚，气不摄血则血溢脉外；阴分亏损，虚火内盛则迫血妄行。我们以此为根据，创立益气养阴方治疗ITP，取得了满意的临床疗效。此方为增血汤合生血散组成（黄芪、鳖甲、太子参、山海螺、紫草、茜草、干芦根、猴骨粉)。黄芪与鳖甲同为君药，黄芪补气固表，鳖甲滋肾潜阳，两药共用气阴双补。太子参、山海螺为臣药，太子参为补气良药，山海螺为补中益气良品，两者配以黄芪，气旺则能固摄，阴血循经而行。芦根、紫草、茜草为佐药，芦根清热生津，紫草清热凉血，茜草凉血止血。猴骨粉祛风除湿、柔肝养血。

本项目组既往研究已证实，益气滋阴方能显著提升ITP患者外周血小板计数[9]，同时对T淋巴细胞亚群的表达有调节作用[10]，包括促使CD3+、CD4+细胞表达增高，CD8+细胞表达下降，而对于ITP发病环节中关键的Treg及其转录因子Foxp3的表达尚无研究涉及。本研究希望通过检测Treg比例、Foxp3mRNA表达水平的变化，阐明益气滋阴方治疗ITP的具体机制。从结果分析，治疗组的总体疗效明显优于对照组，说明益气滋阴方确能提升ITP患者血小板并改善病情。治疗组在治疗后Treg比例及Foxp3mRNA表达水平较治疗前均明显升高，且明显高于对照组治疗后数据，而对照组治疗前后Treg比例及Foxp3mRNA表达水平无明显差异，说明益气滋阴方治疗ITP并提升血小板计数有可能是通过促进Foxp3表达并诱导Treg生成，进而抑制自身反应性T细胞增殖活性，分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子[11]，最终发挥免疫耐受和免疫抑制作用。

该方治疗后患者Treg比例及Foxp3mRNA表达虽然有所恢复，但与正常对照组比较仍明显偏低，这也为本方治疗ITP提供了后续的研究方向和思路，笔者将继续筛选本方的有效成分，以进一步提高本方治疗后患者Treg比例及Foxp3mRNA表达水平为目标，不断提高本病的临床疗效。

[1]Weide R,Feiten S,Friesenhahn V,et al.Outpatient Management of Patients with Immune Thrombocytopenia(ITP)by Hematologists 1995-2014[J].Oncology research and treatment,2016,39(1):41-44.

[2]Zhang A,Ning B,Sun N,Wei J,Ju X.Indirubin Increases CD4+CD25+Foxp3+Regulatory T Cells to Prevent Immune Thrombocytopenia in Mice[J].PloS one,2015,10(11): e0142634.

[3]Zhou Y,Wei K,He L,et al.Multi-central Clinical Research into Treating 80 Cases of Chronic Thrombocytopenia with Qi-supplementing and Yin-nourishing Therapy and Western Medicine[J].Journal of Traditional Chinese Medicine,2011,31(4):277-281.

[4]张志南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:科学出版社，2007:172-174.

[5]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则(试行)[M].北京:中国医药科技出版社，2002:180-184.

[6]Arandi N,Mirshafiey A,Jeddi-Tehrani M,et al.Alteration in frequency and function of CD4(+)CD25(+)FOXP3 (+)regulatory T cells in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].Iranian journal of allergy,asthma,and immunology,2014,13(2):85-92.

[7]Aslam R,Hu Y,Gebremeskel S,et al.Thymic retention of CD4+CD25+FoxP3+T regulatory cells is associated with their peripheral deficiency and thrombocytopenia in amurinemodelofimmunethrombocytopenia[J].Blood, 2012,120(10):2127-2132.

[8]SakaguchiS,MiyaraM,CostantinoCM,HaflerDA. FOXP3+regulatory T cells in the human immune system [J].Nature reviews Immunology,2010,10(7):490-500.

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The Clinical Observation of Influence to Treg and Foxp3 in Immune Thrombocytopenia Treated by Qi-supplementing and Yin-nourishing Prescription

ZHANG Yu,QIAN Lili,CHEN Yin,et al The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006).

[Objective]To explore the effect and mechanism of Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription treated for immune thrombocytopenia. [Methods]Select 112 cases of immune thrombocytopenia patients,randomly divided into control group(conventional western medicine therapy)and treatment group(Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription+conventional western medicine therapy)equally,at the same time establish normal control group including 56 healthy cases.Peripheral blood platelet count and mononuclear cell were detected for percentage of Treg and Foxp3 mRNA expression level. [Results]Treatment group’s overall efficacy was significantly higher than control group 47(83.92%)versus 38(67.86%),P=0.047),treatment group’s Treg and Foxp3 mRNA expression level after treatment were significantly higher than pre-treatment and control group(P＜0.001);The control group’s Treg and Foxp3 mRNA had no obvious difference before and after treatment(P=0.055,0.058);Treatment group’s higher Treg ratio and Foxp3 mRNA expression level were still lower compared with normal control group(P＜0.001).[Conclusion]Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription can promote Foxp3 expression and induce Treg generation,and then treat ITP by restoring the immune balance.

immune thrombocytopenia;Treg;Foxp3;Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription

R543

A

1005-5509（2017）03-0215-04

10.16466/j.issn1005-5509.2017.03.011

2016-11-03）

国家自然科学基金（81603573）

Fund project:National Natural Scientific Foundation(81603573)