15N同位素稀释技术和示踪技术在森林土壤N素研究中的应用

文哲

摘 要 森林土壤N素形态、N库动态及其运移转化特征备受关注。采用稳定性15N同位素稀释技术和示踪技术测定森林土壤总N转化速率和15N回收率，可以揭示森林土壤N素特别是无机N的运移转化规律和持留机制。由此可见，稳定性15N同位素技术在森林土壤N循环研究中的作用举足轻重。基于此，介绍15N同位素稀释技术测定土壤总N转化速率的基本原理和15N同位素示踪技术研究土壤N素运移规律的基本思路，并简要列举了稳定性15N同位素技术和示踪技术在森林土壤N素转化、运移和持留机制研究中的应用实例，同时指出此法的不足和应用前景。

关键词：总N转化速率；持留机制；15N同位素稀释技术；15N同位素示踪技术；同位素分馏

中图分类号：S153.6 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.30.059

1 15N同位素稀释和示踪技术基本原理

15N同位素稀释技术是量化土壤总N转化速率的有效方法，是依赖于对某一形态产物的15N标记及其稀释和富集动态监测[1]，15N同位素示踪技术则主要依赖于对一形态底物的15N的标记及其稀释和富集动态监测。由此可见，利用15N同位素稀释和示踪原理，不仅可以量化土壤N转化速率，还可揭示N素生产和消耗途径。

2 15N同位素稀释和示踪技术方法

目前，利用15N同位素稀释和示踪技术研究N素总转化速率的分析方法有算术分析法和数值分析法两种。基于Kirkham和Bartholomew提出15N同位素稀释法模型，Blackburn提出了低丰度的15N标记方法，公式如下：

m=（M0-M1）/t×log（H0M1/H1M0）/log（M0/M1），c≠m

c=（M0-M1）/t×log（H0/H1）/log（M0/M1），c≠m

m=c=M0/t×log（H0/H1），c=m

式中，M0：培养过程to时刻的N的总含量15N+14N；M1：培养过程t1时刻N的总含量15N+14N；H0：培养过程to时刻15N百分超，即被标记的15N丰度和15N自然丰度之差；H1：培养过程t1时刻15N百分超；t：测定时间间隔即t=t1-to；m：总N产生速率；c：总N消耗速率。

上述方程既可用15NH4+-N或15NO3--N标记[2]。

由于森林土壤N循环过程复杂，需要量化的参数多，而基于算术分析的15N同位素标记方法由于未考虑15N再矿化这一因素，只适合短期测定，且量化的参数少，数值分析法因为克服上述问题越来越受到重视。有关N素总转化速率量化的数值分析法，程谊 等[3]做了很好的归纳。目前，Müller等基于马尔柯夫链蒙特卡洛随机采样方法开发的15N同位素示踪过程模型，将土壤有机N库拆分为活性、惰性氮库，允许采用零级、一级和米门动力学公式对N转化进行描写，可对有机N的矿化、NH4+固持到难分解有机N、易分解有机N的矿化、NH4+固持到易分解有机N、总N矿化、总NH4+固持、自养硝化、异养硝化、总硝化、总NO3-固持和硝酸盐异化为铵（DNRA）等过程进行同步量化，备受关注。

3 森林土壤N转化、运移关键过程的15N同位素研究

森林土壤N素转化过程，如N矿化、硝化、反硝化和硝酸盐异化还原为铵（DNRA）和N微生物固持、植物N素吸收均存在不同程度的N同位素分馏效应。通过N同位素分馏效应的研究，可有效揭示植物、微生物N的利用途径。

利用15N同位素稀释技术和示踪技术来分析土壤N素迁移转化动态，是当前森林生态学一个研究重点。相关研究主要可回答如下问题：第一，森林土壤总N矿化速率和净N矿化速率比例关系及其关键调控因子；第二，森林土壤微生物和植物根系对N素的竞争中谁占优势；第三，全球大气N沉降增加背景下，外源性N输入对不同类型的森林土壤N循环产生的影响。需要说明的是，土壤总N矿化速率和净N矿化速率比例关系因森林类型、土壤肥力和土层深度等不同而有所差异。如Zhang等[4]则采用15N同位素稀释法和模型分析来量化土壤N转化速率，研究发现，与北方温带针叶林相比，中国南方亚热带森林土壤N矿化速率高和N周转快。

运用稳定性15N同位素示踪技术可以揭示森林生态系统植物和土壤微生物的N竞争关系。有关森林植物和土壤微生物对N的竞争的研究主要围绕两点展开，一是在N源的竞争上存在无机N源和有机N源之争；二是在竞争关系上，植物和微生物对N竞争的相对优势。传统观点认为，植物仅能利用土壤有机物经矿化作用形成的无机态N。相应地，植物和微生物对N源的竞争主要围绕NH4+-N和NO3--N展开。植物和微生物对无机N的竞争的证据来源长期和短期的15N同位素示踪实验，土壤无机N库标记丰度较高丰度的15NH4+-N和15NO3--N，经过短期培养（15 d），测定植物、微生物和土壤无机N库及其同位素组成。在长期的15N同位素实验中，采用相同的示踪技术，不同的是测定的时间为培养后的数周或数月。基于15N同位素示踪实验研究的结果，目前较为流行的观点是，短期时微生物在无机N的竞争上占有优势，且微生物偏向于利用NH4+-N，长期而言植物是最终的赢家。近年来，借助15N同位素示踪技术，越来越多的证据显示植物根系，尤其是和菌根真菌有联系的植物根系，可以直接吸收有机态N。植物根系对有机N的吸收能減少植物对微生物矿化N的依赖，潜在缓解植物和微生物对N素的竞争。尽管如此，上述研究仍无定论，尤其是根际土壤微生物-植物的N素营养竞争关系知之甚少。

在全球大气N沉降增加的背景下，当前生态学界普遍关注的一个的问题是外源性N输入对森林生态系统C循环和养分循环有何影响。当外源性N输入超过生态系统生物生理需求和非生物持留能力时，森林土壤出现“N饱和”现象，伴随着NO3--N淋溶加剧、净硝化作用增加、N矿化先增加后降低、气态N损失和土壤酸化等一系列土壤过程非线性变化响应。简而言之，在外源性N输入的情形下，矿物N相对丰富的热带、亚热带和温带森林土壤N循环易由封闭状态向开放状态（如反硝化和淋溶）的转变。而有关N沉降对森林土壤N素循环的影响，多数研究结果集中在净N矿化速率层面。Corre等采用15N同位素稀释法研究则发现，德国云杉林土壤总N矿化、总硝化在中等富N状态下达到最大，在高度富N状态下均有所下降。

4 森林土壤N素持留机制的15N同位素研究

一般来说，矿物N相对丰富的生态系统，如热带、亚热带和温带森林土壤N矿化和硝化速率快，加大了N素流失特别是NO3--N淋溶风险的同时也形成了有效的N素持留机制：如调控植物和微生物对N素的吸收、硝酸盐异化还原为铵（DNRA）、NO3--N非生物性吸持为土壤有机质（SOM）和土壤有机N（SON）再矿化、低土壤pH值抑制氨气（NH3）挥发等。Stark等采用15N同位素稀释技术研究墨西哥和俄勒冈州未受干扰的针叶林土壤NO3--N的动态时发现，尽管土壤总硝化速率相当高，而微生物能快速同化所产生的NO3--N。与Stark等结果一致，Zhu等[5]

采用15N同位素示踪技术对中国亚热带酸性森林土壤研究发现，土壤产生的NO3--N中有17.2%～74.9%被微生物固持。对此，Huygens等[6，7]利用15N同位素稀释技术和15N示踪技术研究智利南部常绿假山毛榉雨林火山土壤的N循环过程，发现异养硝化及其耦合的DNRA过程、NO3--N转化为不易淋溶损失的有机态N、溶解性有机N（DON）转化和溶解性无机N（DIN）过程的解耦三个过程对于原始温带雨林生物可利用性N持留作用重大。他们的研究显示，添加15N一年后，15NH4+-N和15NO3--N的回收率分别为84%、69%，表明大量的NH4+-N和NO3--N被该森林土壤截留。异养硝化作用对总NO3--N生产的贡献达96%，总无机N的贡献约为10%。大约26%通过异养硝化产生的NO3--N经DNRA过程迅速转化为NH4+-N，大约69%通过异养硝化产生的NO3--N固持到不同的有机N库。最近，Zhang等[4]的15N同位素示踪研究显示：中国南方的酸性森林0～20 cm土壤NH4+-N的产生速率为（3.04±0.90）mg/

（kg·d），NH4+-N的固持速率为（1.80±1.13）mg/（kg·d），自养硝化速率为（0.14±0.17）mg/（kg·d），异养硝化速率为（0.70±0.46）mg/（kg·d），NO3--N吸持为SOM速率为（0.65±0.41）mg/（kg·d）和DNRA速率为（0.04±0.03）mg/（kg·d）。中国北方森林0～20 cm土壤NH4+-N的产生速率为（1.80±0.50）mg/（kg·d），NH4+-N的固持速率为（0.59±0.96）mg/（kg·d），自养硝化速率为（1.07±1.57）mg/（kg·d），异养硝化速率为（0.22±0.31）mg/（kg·d），NO3--N吸持为SOM速率为（0.04±0.11）mg/（kg·d）和DNRA速率为（0.05±0.04）mg/（kg·d）。基于上述研究结果，Zhang等[4]阐明中国南方酸性森林土壤无机N的保留机制为低的异养硝化速率、低的NH3挥发速率、较高速率的NO3--N固持为有机N抵消了径流、淋溶和反硝化的影响。

5 研究不足与展望

尽管15N同位素稀释技术和示踪技术能准确地测定森林土壤N素总转化速率，但测定结果受诸多条件限制，存在较大的不确定性。如果不能合理解释利用15N标记测定的结果，易得出误导性的结论。这就要求在实验技术上，确保15N均匀标记于土壤。目前，多孔细针注射法可以降低操作上的误差。另一个问题是，室内溶液注射易改变土壤水分，野外15N的添加可能由于NH3的挥发或NO3--N淋溶造成标记的15N损失，且外源性添加的15N是否产生激发效应（如硝化作用强的森林土壤），有待确定。再者，由于土壤粘土矿物的吸附，起始标记的部分15N如15NH4+-N被吸附，测定N素总转化速率需要待吸附平衡后确定一个合理的起始时间。

当前，有关森林土壤N素总转化速率和土壤温室气体如N2O通量的15N同位素研究十分丰富。然而，极少有研究能将森林土壤含N温室气体通量和土壤N素总转化速率结合分析，同时量化硝化、反硝化过程对N2O排放的相对贡献。在全球大气N沉降增加的背景下，外源性N持续输入在多大程度会影响森林土壤N循环过程、改变植物和土壤微生物间的N素竞争关系；在森林土壤“N饱和”过程中，会形成何种N素持留机制；N沉降增加导致的森林土壤N2O净排放通量发生改变的N素调控机制，和硝化作用和反硝化作用的关系，这些将是今后研究的重点和难点，离不开稳定性15N同位素稀释技术和示踪技术的支撑。

参考文献

[1]Killham， K.Soil ecology[M].Cambridge University Press，1994.

[2]AK Das， L Boral， RS Tripathi， et al. Nitrogen mineralization and microbial biomass-N in a subtropical humid forest of Meghalaya， India[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1997， 29（9-10）：1609-1612.

[3]程谊，蔡祖聪，张金波.15N同位素稀释法测定土壤氮素总转化速率研究进展[J].土壤，2009，41（2）：165-171.

[4] Zhang J， Cai Z， Zhu T， et al.Mechanisms for the retention of inorganic N in acidic forest soils of southern China[J]. Scientific Reports，2012，3（6145）：2342.

[5]Zhu T， Meng T， Zhang J， et al. Nitrogen mineralization， immobilization turnover， heterotrophic nitrification， and microbial groups in acid forest soils of subtropical China[J]. Biology and Fertility of Soils， 2013， 49（3）：323-331.

[6]Huygens D， Rutting T， Boeckx P， et al. Soil nitrogen conservation mechanisms in a pristine south Chilean Nothofagus forest ecosystem[J]. Soil Biology & Biochemistry， 2007，39（10）：2448-2458.

[7]Huygens D， Boeckx P， Templer P， et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils[J]. Nature Geoscience， 2008，1（8）： 543-548.

（責任编辑：赵中正）