西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响

鲍珍贝，杨 青，胡 敏，童静玲

西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响

鲍珍贝，杨 青*，胡 敏，童静玲

目的 考察西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响。方法 将大鼠随机分为空白对照组(空白组)、西洋参总皂苷低剂量组[低剂量组，50 mg/(kg·d)]、西洋参总皂苷中剂量组[中剂量组，100 mg/(kg·d)]、西洋参总皂苷高剂量组[高剂量组，200 mg/(kg·d)]和β-萘黄酮阳性药对照组[阳性药组，80 mg/(kg·d)]，预处理11 d后，观察大鼠肝微粒体CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表达和CYP1A2酶蛋白表达情况，研究CYP1A2特异性探针底物非那西丁在预处理大鼠体内的药动学变化。结果 预处理后，大鼠肝微粒体CYP1A2活性、mRNA和蛋白表达随西洋参总皂苷剂量升高有增加趋势，非那西丁在预处理大鼠体内代谢速率加快。结论 西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性有一定诱导作用。

西洋参总皂苷；大鼠；肝微粒体；CYP1A2；非那西丁

0 引言

西洋参为五加科植物西洋参(PanaxquinquefoliumLinne)的干燥根，性凉，味甘微苦，归心、肺、肾三经[1-2]。具有“补气养阴，清热生津”之功效，临床多用于气虚阴亏，虚热烦倦，内热消渴，咳喘痰血等症[3-6]。现代医学研究表明，西洋参具有抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、保护肝细胞和提高免疫功能的作用[7-10]。

本研究采用西洋参总皂苷对大鼠进行预处理，分别研究大鼠肝微粒体CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表达和CYP1A2酶蛋白表达情况，以及CYP1A2的特异性探针底物非那西丁在西洋参总皂苷预处理大鼠体内的药代动力学性质的变化。从体外和体内实验全面考察西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2酶活性的影响，本研究结果对西洋参总皂苷及其相关制剂和复方的临床应用具有参考价值。

1 材料

1290超高效液相色谱仪、6410B三重四极杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；BioBasic-18色谱柱(2.1 mm×50 mm，5 μm，美国Thomer Scientific公司)；Micro.CL 21R型高速冷冻离心机(美国Thomer Scientific公司)；MultiSkan3酶标仪(美国Thermo公司)；电泳仪、半干槽(美国Bio-Rad公司)；PHS-3D pH仪(上海SANXIN公司)；IKA T10 basic S25匀浆器(德国IKA公司)；KQ 250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLER ME104E型电子天平(瑞士梅特勒公司)。

西洋参药材购自湖北蕲州中药材市场，西洋参总皂苷由本院药学部自制；β-萘黄酮(β-NF)、非那西丁和对乙酰氨基酚(美国Sigma Aldrich公司)；辛伐他汀(IS，中国食品药品鉴定研究院)、NADPH(瑞士Roche公司)。Anti-Cytochrome P450 1A2 antibody(美国Abcam公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；甲酸、磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为纯净水。

普通级雄性SD大鼠，60只，体重230～270 g，由北京维通利华动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK(京)2014-0016。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件 色谱条件：BioBasic-18色谱柱(2.1 mm×50 mm，5 μm)。流动相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱程序为0～1.5 min，15% B；1.5～2.5 min，15%～80% B；2.5～2.6 min，80%～15% B；2.6～3.0 min，15% B。流速0.45 mL/min；柱温为室温。

质谱条件：电喷雾离子源，以多反应离子监测方法进行正离子扫描，毛细管温度300 ℃，毛细管电压4 000 V，雾化电压25 psi，干燥气流速10 L/min。非那西丁、对乙酰氨基酚和内标辛伐他汀的检测离子对分别选择m/z 180.2→110.0，m/z 152.0→110.2和m/z 441.2→325.2。

2.2 生物样品处理 取生物样品100 μL，加入沉淀剂(乙腈∶甲醇=1∶1，含内标100 ng/mL)300 μL，涡旋混合1 min，14 000 r/min离心10 min，取上清进样10 μL进行分析。

2.3 大鼠预处理 取60只大鼠随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组(空白组)、西洋参总皂苷低剂量组[低剂量组，50 mg/(kg·d)]、西洋参总皂苷中剂量组[中剂量组，100 mg/(kg·d)]、西洋参总皂苷高剂量组[高剂量组，200 mg/(kg·d)]和β-萘黄酮阳性药对照组[阳性药组，80 mg/(kg·d)]。空白组给予同等剂量的生理盐水。空白组和低、中、高剂量组连续灌胃给药10 d，在第8天阳性药组腹腔注射β-萘黄酮，连续3 d。每组大鼠等分为2批，分别用于体外和体内实验。

2.5 体外实验[11-14]

2.5.1 CYP同工酶活性测定 大鼠预处理给药结束后，禁食12 h，股动脉放血处死大鼠，并立即切除肝脏，制作大鼠肝微粒体。采用CYP1A2的特异性探针底物非那西丁研究大鼠肝微粒体CYP1A2酶的活性。采用典型的500 μL反应体系，包含0.1 mol的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)，10 mmol MgCl2，0.25 mg/mL微粒体和CYP1A2探针底物非那西丁。混合物的终体积为500 μL，在37 ℃水浴中预孵育5 min，然后加入1 mmol NADPH启动反应，并在反应20 min后加入含有内标的预冷的沉淀剂终止反应。按照上述生物样品处理方法处理，采用LC-MS/MS系统进样分析，测定反应体系中CYP1A2特异性探针底物非那西丁的代谢产物对乙酰氨基酚的浓度来比较5组大鼠肝微粒体CYP1A2的活性(见图1)。

结果显示，高剂量组和阳性药组大鼠肝微粒体CYP1A2活性与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)，低剂量组和中剂量组与空白组比较，大鼠CYP1A2活性增加不显著，但呈现增加趋势，且具有一定的剂量依赖性。

图1 大鼠肝微粒体CYP1A2的相对活性(n=6)

2.5.2 实时定量PCR(RT-PCR)检测结果 RT-PCR法检测大鼠肝脏样本中CYP1A2基因mRNA转录水平的变化情况。预处理大鼠所得肝脏，切取一小块肝左叶迅速在液氮中冷冻并在-80 ℃保存。大约取100～200 mg肝组织进行匀浆，并用Trizol试剂提取总RNA。RNA的含量采用紫外分光光度计进行检测。大鼠肝微粒体CYP1A2的引物依据文献进行设计。反转录采用经典的20 mL反应体系，包含：4单位的Omniscript逆转录酶，1×RT缓冲液，10单位的RNA酶抑制剂，1 mmol的随机六聚物引物，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各0.5 mmol，以及8 mL的总RNA提取物。逆转录反应在42 ℃进行60 min，然后93 ℃保持5 min以终止反应。5 mL cDNA扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶用溴化乙锭染色。采用基因CYC测定基因转录水平的变化，调节每一个肝脏标本RNA的回收率。

结果如图2所示，高剂量组和阳性药组大鼠CYP1A2 mRNA表达与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)，中剂量组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠CYP1A2 mRNA的表达呈现一定的剂量依赖性。

图2 大鼠肝微粒体CYP1A2 mRNA的相对表达(n=6)

2.5.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测结果 用Western blot方法检测大鼠肝脏微粒体样本中CYP1A2酶的蛋白表达情况。大鼠肝微粒体通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，转移到硝酸纤维素膜上。封闭该膜，与一抗和二抗孵育，并在增强的化学发光溶液中浸泡60 s，显影并定影(图3)。结果显示，大鼠CYP1A2酶的蛋白表达随西洋参总皂苷剂量的增加，呈现增加趋势，具有一定的剂量依赖性。

2.6 体内药动学 预处理的另外一批5组大鼠，共30只进行体内非那西丁药代动力学实验。于第11天实验前禁食12 h，自由饮水。按0.5 mg/kg剂量腹腔注射非那西丁。于给药前及给药后5、10、20、30、45、60、90、120、240和480 min，眼球静脉丛取血0.3 mL。4 500 r/min离心10 min，取血浆-30 ℃保存备用。血浆样品按照“2.2”项方法进行处理，并测定药物浓度，分别采用DAS 2.0软件和Origin 8.0软件计算药动学参数和制作药时曲线图(图4，表1)。与空白组比较，低、中、高剂量组和阳性药组的AUC(0-t)分别降低8.88%、23.82%、42.10%和64.95%；低、中、高剂量组和阳性药组的非那西丁清除率(CLz)呈剂量依赖性，逐渐升高。

图3 大鼠肝微粒体CYP1A2的蛋白表达

图4 非那西丁在预处理大鼠体内的药-时曲线(n=6)

表1 非那西丁在预处理大鼠体内的主要药动学参数(n=6)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

随着现代医学对西洋参实验研究和临床研究的逐步深入，西洋参皂苷已被确定为西洋参的主要药效成分，现已分离鉴定出49种，包括32种达玛烷型皂苷，3种齐墩果酸型皂苷，2种奥克梯隆醇型皂苷，另外还有其他皂苷类成分12种[1]。

随着对西洋参研究的深入，其临床应用也在逐渐增加，阐明中药的相互作用对于研究中药的配伍机制和临床的用药安全具有重要意义。但是中药成分复杂，药物的相互作用形式多种多样，其中基于CYP450酶的药物相互作用在中药药物相互作用研究中占很高的比例[15]。CYP450是药物Ⅰ相代谢反应的主要超家族酶系，为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢，参与介导药物的氧化、还原或水解反应。CYP450酶系是导致药物相互作用发生关系最为密切的酶系，凡参与代谢的酶亚型都与药物相互作用有关。而CYP1A2是肝脏微粒体CYP450中比较重要的酶亚型，在药物代谢中发挥重要作用[16]。

为了探讨西洋参总皂苷对大鼠肝微粒体CYP1A2活性的影响，本研究分别通过体外和体内实验进行了探讨。本研究结果显示，西洋参总皂苷干预后，大鼠肝微粒体CYP1A2酶活性、CYP1A2 mRNA表达和CYP1A2酶蛋白表达随干预剂量的增加有不同程度的增加。体内实验发现，西洋参总皂苷干预的大鼠非那西丁药物代谢速率加快，血浆暴露量减少，也具有一定的剂量相关性。

本研究并没有探讨西洋参总皂苷诱导CYP1A2的分子机制。研究表明，芳香烃受体可以介导外源化学物对人类和其他动物的CYP1A2配体介导的基因表达[17]。因此，需要进一步的研究来阐明西洋参总皂苷诱导CYP1A2酶的分子机制，特别是芳香烃受体在该诱导过程可能发挥的作用。

综上所述，西洋参总皂苷对大鼠CYP1A2活性具有一定的诱导作用，长期服用含有西洋参总皂苷的制剂或者复方时，临床联合应用的CYP1A2酶底物药物应该调整给药剂量。此结果可能受限于种属差异，但是对于阐明西洋参总皂苷的药物相互作用机制以及临床合理安全用药仍具有重要意义。

[1] 王蕾,王英平,许世泉,等.西洋参化学成分及药理活性研究进展[J].特产研究,2007,29(3):73-77.

[2] 马宝兰,秦绪花,史载祥.西洋参临床药理研究进展(2004-2010)[J].江西中医学院学报,2011,23(5):88-92.

[3] 陆文娟,周婧,马宏跃,等.黄芪甲苷、人参总皂苷和西洋参总皂苷对蟾酥致小鼠心律失常的影响[J].南京中医药大学学报,2012,28(1):61-64.

[4] 李冬.西洋参茎叶总皂苷通过调节线粒体功能减轻心肌缺血/再灌注损伤的研究[D].北京中医药大学,2015.

[5] 张庆翔，刘剑刚，张蕾，等．西洋参茎叶总皂苷对双联抗致心梗后大鼠胃黏膜损伤的修复作用[J].科学通报，2014，59(12)：1133-1139.

[6] 刘哲,张峰,李丽阳,等.西洋参皂苷对缺血-再灌注诱导乳鼠心肌细胞凋亡及钙浓度的影响[J].中国生物制品学杂志,2014,27(5):661-663,670.

[7] 王丽君.西洋参皂苷和多糖的活性研究[D].中国农业科学院，2013.

[8] 王琛,刘蜜,孙胜,等.西洋参茎叶总皂苷通过抑制过度内质网应激减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤[J].中国病理生理杂志,2013,(1):20-27.

[9] 刘松,金梅香,谭兴文.西洋参茎叶皂苷保护大鼠脑缺血再灌注损伤的作用[J].中成药,2016,38(2):418-421.

[10]王晶,张天英,胡洋,等.西洋参皂苷对大鼠实验性高血脂的影响分析[J].黑龙江医药科学,2015,38(6):125,127.

[11]Zhao Y,Liang A,Zhang Y,et al.Impact of tetrahydropalmatine on the pharmacokinetics of probe drugs for CYP1A2,2D6 and 3A isoenzymes in beagle dogs[J].Phytother Res,2016,30(6):906-914.

[12]Deng Y,Bi HC,Zhao LZ,et al.Induction of cytochrome P450s by terpene trilactones and flavonoids of the Ginkgo biloba extract EGb 761 in rats[J].Xenobiotica,2008,38(5):465-481.

[13]Gao J,Shi Z,Zhu S,et al.Influences of processed rhubarbs on the activities of four CYP isozymes and the metabolism of saxagliptin in rats based on probe cocktail and pharmacokinetics approaches[J].J Ethnopharmacol,2013,145(2):566-572.

[14]Jian TY,He JC,He GH,et al.Scutellarin inhibits cytochrome P450 isoenzyme 1A2 (CYP1A2) in rats[J].Phytother Res,2012,26(8):1226-1230.

[15]Cuciureanu R,Vlase L,Muntean D,et al.Pharmacokinetic Interaction between linezolid and grapefruit juice in rats[J].Farmacia,2010,58(6):770-778.

[16]He X,Feng S,Wang YF,et al.Herb-Drug interaction:effect of isopeulustrin on the metabolism and pharmacokinetics of tetramethylpyrazine by in vivo and in vitro methods[J].Drug Metabolism Reviews,2010,42(2):115.

[17]Kliewer SA,Moore JT,Wade L,et al.An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway[J].Cell,1998,92(1):73-82.

Influence of total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne on the activity of CYP1A2 in rats

BAO Zhen-bei,YANG Qing*,HU Min,TONG Jing-ling

(Luqiao Hospital of Taizhou Enze Medical Center in Zhejiang,Taizhou 318050,China)

Objective To study the influence of total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne on the activity of CYP1A2 in rats.Methods Rats were randomly divided into control group,total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne groups [50,100 and 200 mg/(kg·d)] and positive control group.After pretreatment for 11 consecutive days,the activity,mRNA expression and protein expression of CYP1A2 were measured.The pharmacokinetic changes of phenacetin (probe substrate of CYP1A2) in pretreatment rats were investigated.Results After pretreatment with total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne,the activity,mRNA expression and protein expression of CYP1A2 in rats were improved with dose increasing.The metabolic rate of phenacetin was speeded up.Conclusion Total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne might induce the activity of CYP1A2.

Total saponins fromPanaxquinquefoliumLinne;Rats;Liver microsomes;CYP1A2;Phenacetin

2016-08-30

台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院，浙江 台州 318050

浙江省中医药科学研究基金项目(2015ZB131)；台州市科技局自助A类课题(14SF07)

10.14053/j.cnki.ppcr.201703003

*通信作者