绿原酸对硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)生长的抑制及马铃薯干腐病的控制

杨积鹏，朱艳，曹春梅，李宝军，孙振红，赵新民,李生娥，葛向珍

甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070

1 前沿

硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum)是引起马铃薯干腐病的重要病原物，可通过块茎表皮的伤口、种薯带菌或土壤传播的方式侵入块茎，导致贮藏期块茎发病腐烂，整个块茎僵缩或干腐 [1]。据统计，马铃薯贮藏病害平均病薯率约30%，其中由镰刀菌引起的干腐型病薯约占90%，该菌还具有较强的分泌真菌毒素的能力，主要包括单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠镰刀菌素等，具有潜在的致癌性，容易引发食品安全隐患问题[2]。因此，F. sulphureum引起的干腐病是限制马铃薯产业化发展的重要采后病害之一[1]。

虽然化学杀菌剂处理能有效地控制马铃薯干腐病，但是，化学药物的使用存在环境污染、农药残留、病原物易于产生抗药性等危害[3]，因此，寻找新的有效控制F. sulphureum的方法尤为重要。绿原酸是果实是植物代谢中的重要次生代谢产物，具有清除自由基、抗氧化等作用[4]，对丝状真菌也有一定的抑制作用，是安全无污染的植物源抗菌物质[5]。但是有关绿原酸处理对F. sulphureum的抑制及对干腐病的控制研究还较少。

本试验以菌丝生长和孢子的萌发为指标，研究了不同浓度绿原酸处理对F. sulphureum的抑制影响和对马铃薯干腐病的控制作用，以期为绿原酸在控制F. sulphureum引起的马铃薯贮藏病害提供部分理论依据。

2 材料和方法

2.1 材料与试剂

试供菌株F. sulphureum，为本实验室保存。绿原酸为分析纯，购自Sigma-Aldrich上海贸易有限公司。马铃薯为陇薯3号（Solanum tuberosum Longshu No.3），购于甘肃省农科院马铃薯研究所。

2.2 方法

2.2.1 病原菌的分离、纯化和培养

参照方中达方法[6]，将菌株在PDA培养基平板上培养7d后用打孔器打直径为0.5cm的小菌饼，于新鲜的PDA平板中28℃恒温培养7d待用。2.2.2孢子悬浮液的配制

参照Bi等[7]方法。取培养好的菌体，加含0.05%Tween80的无菌水约10mL，用玻璃棒刮下平板上的孢子转入三角瓶中，充分振荡后，用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数，并稀释至1×106个/mL。

2.2.3 MTT比色法确定绿原酸的抑菌浓度

采用Eloff等人的方法[8]并略做修改，96孔培养板在紫外线下照射10min后每孔加入无菌的PDB培养基、绿原酸的溶液、菌悬液及噻唑蓝(MTT)指示剂，使指示剂的终浓度为0.5mg/mL，绿原酸的终浓度梯度依次为0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 mM，各浓度设3个平行。培养物在无菌条件下28℃保温24h后，用全波长酶标仪（Multiskan TM GO）在490nm波长处测定光吸收值，确定绿原酸的抑菌浓度，试验重复3次 。

2.2.4 绿原酸对F. sulphureum生长的影响

参照葛永红方法[9]并改进。将培养7d的F. sulphureum打成5mm的菌饼接种到添加浓度分别为2.5、5、10mM绿原酸的PDA上，以不添加绿原酸的PDA为对照，分别在3d、5d、7d后测量菌落直径(十字交叉法)确定绿原酸对F. sulphureum 对菌落生长速度的影响。5mm的菌饼接种在PDB培养基中培养7d后过滤烘干菌丝，以菌丝干重测定绿原酸对菌丝生物量的影响。每个处理重复3次。

2.2.5 绿原酸对F. sulphureum孢子萌发的影响

参照葛永红方法[9]并修改，将绿原酸分别加入含5mLPDB培养基的试管中，使其终浓度分别为0、2.5、5、10 mM，同时接种100μL的孢子悬浮液，28℃摇床（200 r/min）培养24h后，用载玻片在光学显微镜观察孢子萌发情况，每个处理计数100个孢子，重复3次。

2.2.6 绿原酸处理后对F. sulphureum接种马铃薯切片病斑的抑制

参照Ray和Hammerschmidt的方法[10] ，选择外观整齐、无损伤的陇薯3号块茎，经次氯酸钠擦洗后将块茎切成一定厚度的切片，用打孔器打成切片，再经酒精消毒后，置于已灭菌的湿滤纸上，在黑暗的恒温恒湿培养箱中25℃放置4h后，分别取500μL浓度为2.5、5、10 mM 的绿原酸溶液，用灭菌接种环均匀涂布后在25 ± 2℃的温度下孵育24h后，接种7d菌龄直径为4mm的F. sulphureum菌饼，每个处理共10个切片，以无菌水处理为对照。切片于黑暗的恒温恒湿培养箱中25℃放置3d，用十字交叉法测量病斑直径，试验重复3次。

2.2.7 数据统计

全部试验数据用Microsoft Excel 2007计标准误差并作图，SPSS19.0进行差异显著性分析。图中竖线表示标准偏差（±SE），字母表示在P<0.05水平下具有统计学水平上的显著差异性。

3 结果与分析

3.1 MTT比色法分析绿原酸对F. sulphureum的抑菌浓度

MTT比色法测定最小抑菌浓度的原理是基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臢（Formazan）并沉积在细胞中，使活细胞呈现蓝色，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臢，在490nm波长有特定的光吸收值，在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的甲臢与活细胞数成正比，因此，酶标仪测得的吸光度值（OD490）可以判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，药物的抑制作用越小。由图1可知，在490nm波长处，不加绿原酸的对照处理吸光值约为0.278±0.01。随着绿原酸浓度的增大，吸光值逐渐降低，说明死细胞数逐渐增高。与对照相比，2.5 mM绿原酸处理后，死亡的细胞数表现出统计学意义上的显著差异，5 mM绿原酸可极显著抑制F. sulphureum，使其死亡。

图1：不同浓度绿原酸处理对F. sulphureum吸光值的影响

3.2 绿原酸处理对F. sulphureum菌丝生长的影响

菌落直径代表了一定时间F. sulphureum在PDA培养基上的径向生长速度。如图2A所示，随着培养时间的延长，F. sulphureum在PDA培养基上的菌落逐渐增大，但绿原酸均可抑制F. sulphureum的径向扩展速度，并呈现浓度效应。F. sulphureum的菌丝生物量也能够被柠檬酸有效抑制(图2B)。与对照相比，2.5 mM的绿原酸处理菌丝干重减少了24.1%，10mM和15mM处理组中，菌丝生物量分别比对照组降低了55.6%和60.2%，在p<0.05的水平下均表现出统计学水平的差异性。

图2：不同浓度绿原酸处理对F. sulphureum菌丝生长的影响。A为菌落直径，B为菌丝生长量

3.3 绿原酸处理对F. sulphureum孢子萌发的影响

不同浓度的绿原酸孵育培养24 h后，F. sulphureum的孢子萌发率表现不同。对照组、2.5mM 、5mM和10mM处理组孢子萌发率分别为39.72%、22.79%、12%和10.05%。与对照相比，2.5mM绿原酸使孢子的萌发率降低了42.62%，5mM绿原酸处理后，孢子萌发被显著抑制，降低了69.79%（图3）。这些结果说明不同浓度的绿原酸在孢子启动萌发过程中，具有一定的调节作用，抑制了孢子的萌发，且随着浓度的增高，这种抑制作用越明显。

图3：不同浓度绿原酸处理对F. sulphureum孢子萌发的影响

3.4 绿原酸处理对接种马铃薯切片病斑直径的影响

陇薯3号马铃薯是甘肃省主栽的重要高淀粉品种，但存在易感病不耐贮藏的特点，因此，试验选择陇薯3号研究绿原酸处理对干腐病发生的影响。由图4可知，绿原酸孵育后接种F. sulphureum菌饼，3d后切片均发病。对照组、2.5mM 、5mM和10mM处理组病斑直径（未去除菌饼的直径）分别为18mm、10mm、7mm和6.8mm。与对照相比，2.5mM绿原酸使陇薯3号马铃薯干腐病病斑直径的扩展降低了44.44%，在P<0.05水平上具有显著差异。

图4：不同浓度绿原酸处理对F. sulphureum马铃薯切片在不同培养时间下的病斑直径

4 结论

绿原酸能有效抑制F. sulphureum孢子萌发、菌落直径和菌丝生物量，同时可显著抑制感病马铃薯陇薯3号的干腐病的发生，抑制效果与浓度呈正相关。

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