针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠行为学及T淋巴细胞亚群的影响*

周双明，刘海静，赵日霞，段必双，郭 瑾，凌 娴

(1.云南省第二人民医院，云南昆明650000;2.云南中医学院，云南昆明650500)

针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠行为学及T淋巴细胞亚群的影响*

周双明1，刘海静2△，赵日霞2，段必双2，郭 瑾2，凌 娴2

(1.云南省第二人民医院，云南昆明650000;2.云南中医学院，云南昆明650500)

目的:探讨针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠行为学及T淋巴细胞亚群数量的影响。方法:选用健康雌性成年SD大鼠60只，随机分为空白对照组、模型组、针刺治疗组、音乐治疗组和针刺音乐治疗组(简称音针组)。采用不可预知的慢性情绪应激方法制作焦虑模型，造模同时，针刺组、音乐组和音针组分别进行相应治疗，观察大鼠各组体重增长和行为学的变化、检测全血T淋巴细胞亚群表达的百分率。结果:①针刺组和音针组大鼠体重较模型组显著增长;②3个治疗组第21天OT%值、OE%值、旷场试验水平得分及垂直得分均较模型组显著升高;③与空白组相比，模型组CD8+显著降低，CD4+/CD8+显著升高，针刺组及音针组CD8+较模型组显著升高，CD4+/CD8+较模型组显著下降。结论:针刺结合音乐疗法及针刺疗法对焦虑模型大鼠的T淋巴细胞亚群起到了良性调节作用。针刺结合音乐疗法有较好的抗焦虑作用。

焦虑症;针刺;音乐疗法;T淋巴细胞亚群

流行病学调查显示，广泛性焦虑症的发病率呈逐年升高的趋势，因此，探讨GAD的发病机制并且发现有效可行的治疗方法意义深远。近年来，针刺疗法凭借对本病显著的临床疗效和较少的毒副作用，日益受到患者及家属的信赖，医学界也开始广泛关注针刺疗法对该疾病的治疗及机理研究。本研究采用不可预知的慢性情绪应激法建立焦虑大鼠模型，从行为学角度探讨针灸结合音乐疗法的抗焦虑效果，从免疫细胞的角度探讨针刺结合音乐疗法治疗广泛性焦虑的部分免疫学机制，为其治疗焦虑症的推广应用提供理论依据，并为焦虑症的病机研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

健康SD大鼠，雌性，清洁级，65只，体质量220～260 g，购自于四川省实验动物检测中心;抗CD3+-APC、抗CD4+-PE、抗CD8+-FITC、溶血素(以上购自于美国BD公司)、PBS溶液(云南省中医院中心实验室自备);高架十字迷宫(elevated plus-maze，EPM)，采用国际通用方法自制;旷场实验(Openfield test):自制立方体敞箱;流式细胞仪:BD AccuriTM C6(美国 BD公司产);电子天平:Mettler Toledo MS104S(瑞士Mettler Toledo公司生产);手术用器械:镊子、手术剪、止血钳等。

1.2 动物造模

本研究采用慢性情绪应激-CES(Chronic Emotion Stress)改进制作焦虑症模型［1-2］。于第8天起除空白组外，其余4组大鼠接受不可预见性共9种应激刺激，连续随机安排3周，每种刺激形式不在连续的2天出现。分别为24 h禁食、24 h禁水、两笼混为一笼、单笼、倾斜、从两笼各抓两只混笼、24 h光照、24 h黑暗、不可逃避的足底电击(每只大鼠每次接受电流强度10 mA，20次电击，间隔30 s行下1次电击，电流持续时间5 s/次)。

1.3 动物分组及处理方法

动物适应1周后，通过旷场实验将垂直运动次数和水平运动次数相加，次数不足30次或超过120次的大鼠剔除后，进行编号，查随机数字表分为空白对照组、模型组、针刺治疗组、音乐治疗组和针刺音乐治疗组(音针组)5组，每组12只。除空白组外，其它4组动物均给予连续21天不可预见性的刺激。针刺治疗组和针刺音乐治疗组及音乐治疗组均在每次治疗结束1 h后对大鼠进行造模试验，具体方法同模型组。

1.3.1 针刺取穴 参照《实验针灸学》(全国协编教材)大鼠穴位定位［3］，取“百会”“内关”“三阴交”，进行针刺治疗。

1.3.2 针刺操作方法 取针身长度为2 mm的32号麦粒型皮内针用于“百会”的针刺，取针身长度为5 mm的32号图钉型皮内针用于“内关”和“三阴交”的针刺，每次留针30 min，每日1次，共21天。

1.3.3 音乐治疗 将大鼠置于黑暗密闭空间，用录音机播放音乐45 min。针刺音乐治疗组在大鼠进行针刺治疗留针期间进行音乐治疗。

1.4 一般情况观察

观察各组大鼠精神、活动状态。分别于实验开始的第1天和第21天测量各组大鼠体重，观察各组大鼠体重增长变化情况。

1.5 行为学测试

1.5.1 高架十字迷宫实验 大鼠从中央区面向闭合臂放入迷宫，记录5 min内活动的情况。观察指标:开放臂进入次数(OE);闭合臂进入次数(CE);开放臂停留时间(OT);闭合臂停留时间(CT)。分别计算大鼠进入开臂的次数(OE)占两臂总次数(TE)的百分比以及大鼠在开臂停留时间(OT)分别占总时间(TT)的百分比。

1.5.2 旷场试验 将大鼠置于敞箱底面的中心方格内，以动物穿越底面的格数为水平运动次数，以后肢直立次数为垂直运动次数。于实验开始后的第7、14、21天进行行为学测试，各组大鼠交叉进行。

1.6 T淋巴细胞亚群表达百分率检测

流氏细胞仪检测全血 T淋巴细胞亚群 CD3+、CD4+、CD8+水平。具体步骤为:取大鼠外周抗凝全血(内眦静脉取血)30 ul;分别添加5 ul抗 CD3+、抗CD4+、抗CD8+表面抗体，重悬，室温避光孵育15 min; 2倍稀释溶血素，加入1 ml稀释后的溶血素裂解红细胞10 min，加入2 ml PBS溶液洗1次，1200转/min离心5 min弃上清，用500 ulPBS溶液重悬;2 h内上机检测。

1.7 统计学处理

本实验采用SPSS19.0统计系统对数据资料进行分析，所有统计数据采用±s表示。组间差异比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)，组间两两数据比较前进行方差齐性检验，满足方差齐性则采用LSD检验，方差不齐采用Tamhane，s T2检验，以P＜0.05作为显著性差异的标准。

2 结果

2.1 一般情况

空白组大鼠精神状态良好，皮毛有光泽，行动敏捷。模型组大鼠较空白组大鼠皮毛晦暗，反应迟钝，梳理毛发动作明显过多。经3周治疗干预后，3个治疗组大鼠以上表现明显好转。

2.2 体重变化

与模型组比较，针刺组和音针组大鼠体重增长显著(P＜0.01)。见表1。

2.3 行为学测试

2.3.1 OT/TT(%) 第21天3个治疗组较模型组均显著升高(P＜0.0l);第21天音针组OT%值较音乐组明显升高(P＜0.01)。见表2。

2.3.2 OE/TE(%) 3个治疗组第21天OE%值较模型组明显升高(P＜0.01或P＜0.05)，三者比较均无显著差异。见表3。

表1 各组大鼠体重增长比较(±s)

表1 各组大鼠体重增长比较(±s)

注:与空白组比较，△P＜0.01;与模型组比较，◇P＜0.01

组别 n 体重增长(g)空白组12 83.25±9.94模型组 12 24.33±5.66△针刺组 12 38.50±7.33△◇音乐组 12 30.33±8.17△音针组 12 43.20±22.53△◇

表2 各组大鼠OT/TT(%)比较(±s，n=12)

表2 各组大鼠OT/TT(%)比较(±s，n=12)

注:与空白组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01;与模型组比较，◆P＜0.01;与音乐组比较，▼P＜0.01

组别 7天 14天 21天空白组14.14±2.65 12.86±3.31 13.36±3.30模型组 2.83±1.37▲1.97±0.97▲1.08±0.93▲针刺组 3.31±0.88▲3.08±0.78▲9.53±2.04△◆音乐组 3.25±1.12▲2.94±1.25▲7.08±2.06▲◆音针组 3.50±0.69▲3.25±1.14▲11.06±2.70◆▼

表3 各组大鼠OE/TE(%)比较(±s，n=12)

表3 各组大鼠OE/TE(%)比较(±s，n=12)

注:与空白组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，◇P＜0.05，◆P＜0.01

组别 7天 14天 21天空白组30.58±8.48 32.01±8.79 33.21±7.88模型组 11.07±6.40▲7.59±6.81▲4.11±3.24▲针刺组 11.00±5.40▲8.90±6.61▲17.40±6.15▲◆音乐组 10.27±4.84▲7.27±7.34▲14.46±9.53◇▲音针组 12.12±5.70▲11.64±6.84▲22.68±9.38◆

2.3.3 旷场试验水平得分 与模型组比较，第14和第21天3个治疗组水平得分较模型组均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。其中音针组第21天水平得分明显高于针刺组(P＜0.01)。见表4。

表4 各组大鼠旷场试验水平得分比较(±s，n=12)

表4 各组大鼠旷场试验水平得分比较(±s，n=12)

注:与空白组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，◆P＜0.01;与针刺组比较，▼P＜0.01

组别 7天 14天 21天空白组76.25±14.65 71.67±12.87 79.58±7.13模型组 38.08±7.40▲31.92±7.76▲23.25±9.73▲针刺组 44.50±11.37▲48.08±9.71▲◆55.83±5.91▲◆音乐组 46.50±11.78▲51.00±9.92▲◆61.67±10.28▲◆音针组 46.92±9.15▲55.25±8.30▲◆67.58±8.88▲◆▼

2.3.4 旷场试验垂直得分 与模型组比较，第14天音针组及音乐组垂直得分显著升高(P＜0.01)，其中，音针组第14天垂直得分较针刺组明显升高(P＜0.05)。第21天3个治疗组垂直得分较模型组升高有显著差异(P＜0.01)。音针组第21天垂直得分较音乐组及针刺组显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。见表5。

表5 各组大鼠旷场试验垂直得分比较(±s，n=12)

表5 各组大鼠旷场试验垂直得分比较(±s，n=12)

注:与空白组比较，▲P＜0.01;与模型组比较，◆P＜0.01;与音针组比较，▽P＜0.05，▼P＜0.01

组别 7天 14天 21天空白组20.92±3.78 19.42±4.85 22.08±3.63模型组 10.17±3.01▲8.42±2.39▲4.92±1.98▲针刺组 10.83±3.69▲11.08±3.37▲12.67±2.84▲◆▼音乐组 11.75±4.14▲12.08±2.68▲◆13.92±2.68▲◆▽音针组 12.08±2.15▲14.33±3.20▲◆16.83±2.95▲◆

2.4 T淋巴细胞亚群表达百分率

经过3周的造模及治疗后，数据显示，与空白组相比，模型组CD8+降低显著(P＜0.01)，CD4+/CD8+明显升高(P＜0.05)，CD3+有下降趋势，但未达统计意义(P＞0.05)，CD4+未见明显变化(P＞0.05);3个治疗组各数值与空白组无显著差异。与模型组相比，针刺组、音针组的CD8+均明显升高(P＜0.01)，针刺组、音针组CD4+/CD8+的比值较模型组降低显著，差异有统计学意义(P＜0.05);3个治疗组CD3+较模型组均有升高趋势，但差异不显著(P＞0.05);各组CD4+较模型组未见明显变化(P＞0.05)。音针组与针刺组各组数据之间无明显差异(P＞0.05)。见表6。

表6 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化(±s，n=12)

表6 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化(±s，n=12)

注:与空白组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01;与模型组比较，□P＜0.05，■P＜0.01

组别 CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+空白组56.70±3.48 41.33±2.86 22.38±2.41 1.859±0.161模型组52.49±6.36 40.85±4.75 18.43±1.88▲2.232±0.305△针刺组55.44±5.74 41.05±4.44 22.23±3.11■1.898±0.377□音乐组55.35±5.10 41.15±5.69 20.34±3.12 2.068±0.463音针组56.68±5.63 41.22±3.67 21.98±3.12■1.907±0.292□

3 讨论

针灸治疗焦虑症已有大量临床报道［4-6］。也有研究证实音乐和歌声能有效改善情感障碍患者认知功能和社交能力，有效干预和缓解情感障碍患者抑郁、焦虑程度及躯体、精神痛苦，从而提高患者生理、心理健康水平［7-9］。但针刺与音乐疗法相结合对焦虑症的作用尚未见报道。本研究采用不可预知的慢性情绪应激法建立焦虑大鼠模型，采用目前公认的高架十字迷宫试验以及旷场实验两种行为学评测方法［10-12］对大鼠行为进行测评，采用流式细胞仪检测大鼠全血T淋巴细胞亚群表达的百分率。从行为学角度探讨针灸结合音乐疗法的抗焦虑效果，从免疫细胞的角度探讨针刺结合音乐疗法治疗广泛性焦虑的部分免疫学机制。

本研究中高架十字迷宫实验(焦虑程度评估)结果提示，不可预知的慢性情绪应激制造焦虑模型方法可显著减少大鼠在开放臂的停留时间和大鼠进入开放臂的次数，表明大鼠已处于明显焦虑状态，提示本实验造模成功。而3种治疗方法均可增加焦虑模型大鼠在开放臂的停留时间和进入开臂次数的比例，提示3种治疗方法均对模型大鼠的焦虑行为有明显缓解作用。音针组显著优于音乐组和针刺组。

旷场试验(活动性和探究行为)结果提示:不可预知的慢性情绪刺激制造焦虑模型方法可显著减少大鼠水平移动格数次数和直立次数，而3种治疗方法均可增加焦虑模型大鼠的水平移动格数和直立次数，提高焦虑大鼠的活动性和探究行为。音针组显著优于音乐组和针刺组。

免疫系统与情绪活动以及精神障碍之间存在着复杂的关系，但其心身交互作用机制及其因果关系目前尚不十分清楚。许多研究指出免疫功能的改变影响认知功能［13-14］。从现代医学看，机体细胞免疫功能、体液免疫功能等与不良负性情绪密切相关［15］。D Atanackovic等［16］研究发现心理治疗期间的焦虑障碍患者外周血CD4+/CD8+比值显著升高，CD8+降低。庄洁等［17］发现处于高应激状态下的不同特质焦虑运动员，高焦虑组CD4+/CD8+比值明显下降，CD4+明显减少。可见，不良情绪及心理应激可致免疫系统功能紊乱。免疫功能紊乱涉及免疫细胞、免疫分子多个方面。

T淋巴细胞作为人体最重要的免疫细胞之一，T淋巴细胞之间的细微平衡对维持免疫系统内环境稳定起到至关重要的作用［18］。CD3+T细胞反映总T淋巴细胞水平。成熟T淋巴细胞中细胞免疫有两类重要效应细胞，CD4+T细胞和CD8+T细胞［18］。CD4+T主要功能是辅助或诱导免疫反应。CD8+T主要为抑制性T细胞(Ts)或细胞毒性T细胞(Tc)，主要发挥杀伤和抑制作用，是免疫反应中直接杀伤性细胞。CD4+/CD8+比值在一定程度上表示辅助性T细胞(Th)和抑制性T细胞(Ts)比值，反映了机体细胞免疫功能状态是否稳定，是判断机体免疫功能的敏感指标。CD4+/CD8+比值倒置或下降提示机体免疫功能紊乱。CD4+/CD8+降低代表细胞免疫功能降低，处于免疫抑制状态，是免疫缺陷的重要指征;其增高表明细胞免疫功能处于“过度活跃”的异常状态。免疫器官的脏器指数直接的反应了该免疫器官的大小，是反映脏器受损的一个灵敏、有效和经济的指标［19］。

针刺对机体免疫功能有良好、整体调整作用［20］。有研究显示针刺疗法可调节焦虑妇女受损的免疫功能，明显增强NK细胞活性，明显升高过低的淋巴细胞增殖，明显降低过高的淋巴细胞增殖［21］。音乐疗法对机体免疫系统亦有调节作用。有学者报道连续8天播放某德国乐曲，5 h/天，结果BALB/c小鼠T细胞数目增加，增值反应增强［21］。由此可见适宜的音乐刺激可改善人和动物的不良情绪，增强其免疫功能。

本实验通过流式细胞仪对各组大鼠T淋巴细胞亚群进行检测，结果表明:针刺结合音乐疗法及针刺疗法可有效升高慢性情绪应激所致焦虑模型大鼠降低的CD8+，降低焦虑大鼠过高的CD4+/CD8+，对焦虑模型大鼠机体内T淋巴细胞亚群起到了良性调节作用。

本实验从行为学证实了针刺结合音乐疗法对焦虑模型大鼠焦虑征象的有效性，从T淋巴细胞方面证实了焦虑模型大鼠存在T细胞免疫功能紊乱，并揭示针刺结合音乐疗法及针刺疗法调节T细胞免疫功能的有效性，但其作用机制与途径还有待进一步研究。

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Effect of Acupuncture Combined with Music Therapy on Behavior and T Lymphocyte Subsets in Anxiety Disorder Model Rats

ZHOU Shuang-ming1，LIU Hai-jing2△，ZHAO Ri-xia2，DUAN Bi-shuang2，GUO Jin2，LING Xian2
(1.Yunnan Second People＇s Hospital，Kunming 650000，China;2.Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China)

Objective:To explore the effect of acupuncture combined with music therapy in anxiety disordered (AD)rats by exploring changes in behavior and T lymphocytes.Methods:Female SD rats were randomly divided into normal(N)，model(M)，acupuncture therapy(AT)，music therapy(MT)and acupuncture combined with music therapy(AMT)groups.Chronic unpredictable emotional stress lasted 21 days to establish AD rat models.All the rats were observed according to the weight changes during 21 days.Behavioral activity was measured by using the elevated plus-maze and open-field test in all rats.Observe T lymphocytes subgroup by using flow cytometry.Results:1.Changes in weight gain:Compared with the M，weight gain in AT and AMT was significantly higher 2.Behavior tests:Elevated Plus-maze Test:OT%，OE%in AT，MT and AMT were significantly higher than those in M on the 21st day.Open-field Test:Horizontal scores and Vertical scores in AT，MT，AMT were significantly higher than those in M on the 21st day.3.T lymphocytes subgroup:The data showed CD8+in M was significantly lower than that in N(P＜0.01)，and CD4+/CD8+in M were significantly higher than those in N(P＜0 05);CD8+in AT and AMT was significantly higher than that in M(P＜0 01).CD4+/CD8+in AT and AMT were significantly lower than those in M(P＜0.05).Conclusion:It is suggested that AMT has a good anti-anxiety effect.Moreover，ATM and AT can regulate the level of T lymphocytes in anxiety disorder rats.

Anxiety disorder;Acupuncture;Music therapy;T lymphocytes subgroup

R246.6

A

1005-0779(2017)03-0057-04

2016-08-28

云南省医疗卫生单位内设研究机构(针灸研究中心)科研项目，编号:YN2015021。

周双明(1985-)，女，主治医师，主要从事中医针灸治疗心身疾病的临床及基础研究。

△通讯作者:刘海静(1973-)，女，副教授，主要从事中医针灸治疗心身疾病的临床及基础研究。