安神脐贴对PCPA致失眠大鼠自主活动及GABA、5-HT含量的影响＊

2017-03-27焦富英李国信牟朝清

世界科学技术-中医药现代化 2017年12期

焦富英，李国信，马进，牟朝清，甘雨，乔敏，乔铁

（1.辽宁中医药大学附属第二医院沈阳 110034；2.辽宁中医药大学沈阳 110032）

失眠（insomnia）又称睡眠障碍（sleep disorders，SD），是指患者睡眠质量差，不能满足个体生理需要，因而影响白天正常工作学习的睡眠障碍综合征[1]。失眠属于中医的不寐范畴，是由心神失养或心神不安所致。不寐在《内经》中称“不得卧”、“目不暝”，认为是邪气客于脏腑，卫气行于阳而不得入阴而成。中医认为不寐的病因病机是阳胜阴衰，阴阳失交，其治疗原则当以补虚泻实，调整脏腑阴阳为主。中医治疗失眠疗效显著，安全可靠，副作用较小，无依赖性，是多数失眠患者的首选治疗方法。中医对失眠的常规疗法为口服汤剂和针灸治疗，然而口服汤剂有伤脾胃之弊端，针灸有患者晕针之顾虑，为此我们采用安神脐贴外治疗法治疗失眠。为了验证安神脐贴对失眠有确切疗效，我们设计了本实验，通过观察失眠大鼠用药前后自主活动的变化情况及血清中神经递质五羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的含量变化来观察安神脐贴对失眠的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要仪器

SD大鼠，雄性，SPF级，体重180-220 g；购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。EthoVision大小鼠行为学系统，荷兰NOLUDS公司生产；电热恒温水浴箱，由辽宁中医药大学附属二院检验科提供，规格型号：HH-W21-600；全自动快速立式洗板机，由辽宁中医药大学附属二院检验科提供，规格型号：JB-1。受试动物购入后在辽宁中医药大学附属二院实验动物研究中心适应性观察饲养后使用。许可证号：SYXK（辽）2012-0003。观察室温度20-23℃，相对湿度50%-60%。

1.2 实验药物与试剂

安神脐贴由辽宁中医药大学附属第二医院制剂中心提供；同仁安神丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，批号：15015079；对氯苯丙氨酸（4-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA）由SIGMA公司生产，批号：SHBD9164V；生理盐水，华仁药业股份有限公司生产，批号：Q1611028。Rat 5-HT Elisa kit试剂盒和Rat GABA Elisa kit试剂盒，均购自沈阳天瑞生物科技有限公司，批号：201703。

1.3 模型制备与分组

取健康SD大鼠50只，体重180-220 g，雄性。大鼠腹部剃毛，24 h后按随机数字表法分为5组，分别为空白对照组、模型对照组、安神脐贴高剂量组（5.40 g/kg/日）、安神脐贴低剂量组（1.35 g/kg/日）、同仁安神组（2.16 g/kg/日），每组10只。除空白对照组外各组大鼠腹腔注射PCPA（350 mg·kg-1），每日1次，连续2日，建立失眠大鼠模型。从第3日开始空白组和模型组在神阙穴部位敷空白贴，安神脐贴组每天在神阙穴部位分别给予相应剂量的安神脐贴，同仁安神丸组灌胃给药，连续给药5天。安神脐贴组每日更换相应剂量的脐贴，同仁安神丸组每日按规定剂量灌胃给药。高、低剂量的安神脐贴形状相同，含药量不同。实验动物于末次给药60 min后，采用EthoVision大小鼠行为学系统记录大鼠自主活动情况，自主活动测试箱为1.0 m×1.0 m正方形不锈钢箱，箱内中央0.5 m×0.5 m正方形区域划分中央区，其余为周边区，记录10 min内大鼠移动距离、速度、出现在中央区的频率及在中央区累计停留时间。取各组大鼠血清，测五羟色胺（5-HT），γ-氨基丁酸（GABA）含量。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 安神脐贴对大鼠自主活动的影响

正常SD大鼠连续2天以350 mg·kg-1的PCPA腹腔注射后，昼夜睡眠-觉醒平衡规律被破坏，提示造模成功。行为学表现为不分昼夜的自主活动度增高，并出现焦躁，食欲减退，精神萎靡等现象。给予安神脐贴、同仁安神丸治疗5天后，大鼠的睡眠-觉醒规律慢慢恢复，表现为白天活动度减少，安静，倦怠，蜷卧，不易被外界打扰，精神好转，食欲渐增。与模型组相比，安神脐贴低剂量组和同仁安神丸组大鼠自主活动的速度、移动距离差异显著(P＜0.05），安神脐贴高剂量组大鼠自主活动的速度、移动距离差异非常显著(P＜0.01）。提示安神脐贴和同仁安神丸对PCPA致失眠大鼠均有镇静作用，但安神脐贴组效果更明显。详见表1。

表1 安神脐贴对PCPA致失眠大鼠自主活动的影响(±s,n=10)

注：与空白对照组比较：＊P＜0.05；与模型对照组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

图1为各组PCPA致失眠大鼠运动轨迹。由图1可见，PCPA造模后，大鼠运动明显增多，经安神脐贴治疗后，运动减少，高剂量组减少明显，同仁安神丸也可减少大鼠的自主的活动。但是安神脐贴高剂量组自主活动减少最明显。

2.2 安神脐贴对各组大鼠血清中GABA、5-HT含量的影响。

实验7天后，各组大鼠处死，取血清，采用ELISA法测5-HT，GABA含量。结果显示，模型组血清中GA⁃BA含量低于空白组，差异有统计学意义，安神脐贴低剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），安神脐贴高剂量组和同仁安神丸组与模型组比较，差异有非常显著统计学意义（P＜0.01）。模型组血清中5-HT含量明显低于空白组，差异有统计学意义；安神脐贴低剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），安神脐贴高剂量组和同仁安神丸组与模型组比较，差异有非常显著统计学意义（P＜0.01），安神脐贴高剂量组疗效好于同仁安神丸组。说明安神脐贴对PC⁃PA致失眠大鼠神经因子GABA、5-HT有调节作用。提示安神脐贴调节睡眠的机制与调节具有促眠作用的因子GABA、5-HT有关。详见表2。

图1 各组PCPA致失眠大鼠运动轨迹图

表2 各组大鼠血清中神经递质含量变化(±s,n=10)

注：与空白对照组比较：*P＜0.05与模型对照组比较：#P＜0.05，##P＜0.01

5-HT（ng·L-1）122.57±4.37##102.14±7.21**120.35±4.94#128.85±6.10*##124.14±5.40##空白对照组模型对照组安神脐贴低剂量组安神脐贴高剂量组同仁安神组GABA（μmol·L-1）5.30±0.22##4.36±0.37**4.88±0.21*#5.36±0.60##5.42±0.38##

3 讨论

睡眠是保证人体健康、使疲劳的身体快速复原、保持精力的有效途径。正常人大概有三分之一的时间都处于睡眠状态，只有保证充足的睡眠生命体才能正常有序的进行各种生命活动。然而，随着社会的不断发展，工作压力的不断增大，失眠所带来的问题也越来越严重[2-4]。中医认为失眠的主要病位在心，然心为火脏，火静则神安而寐，火盛，则魂不守舍而失眠。心火亢盛，心经火胜是失眠在临床中常见的分型，其治疗多从清心火、安心神入手。安神脐贴由酸枣仁、黄连、五味子，琥珀粉按照16∶14∶14∶1的比例配伍而成，主要针对心火偏盛型失眠。酸枣仁味甘酸，性平，主归心、肝、胆经，为养心安神之要药。黄连味苦性寒，主归心经，尤善清泻心经实火。五味子，味甘酸性温，主归心、肾经，具有补益心肾，宁心安神之功效。琥珀味甘性平，主归心，肝二经，其质重而镇，具有镇静安神之功效。四味药物相辅相成，共同发挥清心泻火，宁心安神之功效。药物贴脐疗法至今已有2000多年的历史，是以中医经络学说为理论基础，针对不同疾病的不同需要，选择相应药物，贴敷于肚脐即神阙穴的部位，使药物通过脐部皮肤渗透和经络传导作用到达患病部位从而发挥药效的一种传统医学外治疗法。在《五十二病方》现存283个配方中，有70多个配方涉及到脐疗法，开创了脐疗法的先河[5]。脐是神阙穴所在的位置，为生命的元神所居。神阙为任脉的重要穴位[6]，又是冲脉循行之处，任脉为阴脉之海，与阳脉之海督脉互为表里，冲脉为血海，督、任、冲三脉“一源三岐”，内联五脏六腑，外达四肢百骸，皮肤筋膜，无处不走。此为脐疗法治疗多种疾病提供了理论依据。现代研究认为[7-8]，脐在胚胎发育过程中为腹壁最后闭合处，其下分布着丰富的静脉网和皮下动脉分支，与人体其他部位皮肤结构相比，其表皮角质层最簿，屏障功能最弱，有利于药物渗透吸收。由于药物透皮吸收和皮肤厚度成反比，与皮肤的扩散性成正比，所以脐部的特殊构造具有透皮疗法的得天独厚的优势。除此以外，药物分子可通过脐部进入细胞间质，直接进入血液，避免口服经过胃肠被消化液破坏而影响药效发挥，同时又能减少药物给肝肾带来的不良反应，以及对胃肠道的刺激和对消化功能的不良影响。

失眠与中枢神经系统兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸神经递质的平衡失调密切相关[9]。现有实验研究表明，睡眠障碍患者的中枢神经系统内神经递质含量发生改变，致使兴奋和抑制的平衡被破坏[10]。GABA是一种非蛋白质性氨基酸，是一种重要的抑制性神经递质，能够对大部分神经元发挥抑制作用，其表达量的多少在睡眠的调节过程中发挥着重要作用[11]。另有实验研究表明[12]，当大脑处于睡眠状态时大脑皮层所释放的GABA含量是清醒状态时的3倍。因此失眠与血清中GABA表达量的多少有密切关系。本实验研究结果显示，安神脐贴能够升高抑制性氨基酸GABA的表达量，对失眠有良好的调节作用。研究发现单胺类神经递质5-HT参与调解多种生理功能，其主要集中在脑干中缝核(DRN)，在中枢系统内数量较少，但其轴突分布广泛，可支配脑的所有区域，调控脑的总体功能，下丘脑内存在“睡眠中枢”和“觉醒中枢”，下丘脑与脑干处的相关区域相互作用，共同完成对睡眠-觉醒的调节[13，14]。近年来研究发现，单独使用5-HT也能起到增加睡眠的作用，证实了5-HT是能够促进睡眠的神经递质[15-17]，5-HT浓度升高时，肌体就会感到疲乏并产生睡意。PCPA是一种色氨酸类抑制剂，通过减少色氨酸摄入和增加转运载体数量来减少大脑内5-HT合成和释放[18]。PCPA致失眠大鼠模型是目前公认的并广泛应用于各类神经递质关系研究的经典模型。

本实验结果显示：安眠脐贴能减少大鼠的自主活动次数，提示安眠脐贴有明显的镇静作用。腹腔注射PCPA可导致大鼠血清神经递质GABA、5-HT表达量发生显著变化，采用安神脐贴低剂量、高剂量干预后，与模型组相比，GABA、5-HT的表达量升高。可见，安神脐贴有明显的镇静作用，安眠脐贴调节睡眠的机制与调节具有促眠作用的因子GABA、5-HT有关，抑制兴奋促进睡眠，调节睡眠-觉醒周期平衡。

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3 Nowicki Z,Grabowski K,Cubala W J,et al.Prevalence of selfreported insomnia in general population of Poland.Psychiatr Pol,2016,50(1):165.

4 Wong W S,Fielding R.Prevalence of in insomnia among Chi⁃nese adults in Hong Kong:a population-based study.J Sleep Res,2011,20(1):117.

5 朱玲.脐疗中医特色治疗.首届兰茂中医药发展学术论坛暨云南省中医药界2014学术年会论文汇编,2014.

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7 于华,候喜连,孔雪萍.“蝴蝶效应”与脐疗机制探讨.光明中医,2007.22(8):2-4.

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11 王冰梅,于江波,王永彬,等.安神补脑软胶囊对老年失眠模型大鼠下丘脑5-羟色胺1a、5-羟色胺2a、γ-氨基丁酸表达量的影响.中国老年学杂志,2015,35(9):4784-4786.

12 邓丽影.脑卒中后觉醒障碍.中国现代神经疾病杂志,2013；13(6):476-480.

13 宋媛,赵仓焕,任莉.不同穴位处方麦粒灸对失眠大鼠下丘脑单胺类神经递质的影响.暨南大学学报(自然科学与医学版),2009,30(2):185-188.

14 刁远明,陈群.安寐汤对失眠大鼠脑组织多巴胺含量的影响.中国医药导报,2011,8(17):105-107.