长链非编码LncRNA与雄性生殖初探

刘康生　沈一婷　潘峰　陈亚军

高等生物体能通过转录生成大量RNA，尤其以哺乳动物转录出的 RNA 数量庞大且种类繁多,而这些转录本中，只有非常小的一部分(约 25000 个基因)可以编码产生蛋白质或者多肽,这些编码蛋白质的序列总长度只占基因组序列的约 2%，剩余的转录本均可归类为非编码RNA(non-coding RNA)。ncRNA 基本包括 siRNA、miRNA piRNA，lncRNA等几大类，ncRNA 根据其分子链长度可进一步分为长度小于200nt的短链非编码RNA (small non-coding RNA,sncRNA)和大于200nt的长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。LncRNAs通常是多聚腺苷酸化的，受 RNA 聚合酶 Ⅱ 催化转录合成，主要分布于胞核，在胞浆中也有存在[1]。科学界曾经认为,相对于功能基因这一类不编码蛋白质的 RNA 是转录背景噪音(不具备实质性的生物学功能)[2-3]。近来的研究表明所关注对象lncRNA普遍表达在哺乳动物细胞里具有非常广泛的生物学功能。随着研究的不断深入，发现人类基因组虽然有大量转录物产生，但mRNA 在转录物中的比重仅占 1.2%，而 ncRNAs 在转录组中的含量竟高达98%以上[4]，提示ncRNAs 可能在生物体内具备丰富的生物学功能。在过去的研究中，sncRNA 作为分子生物学领域的研究热点，已被证实能在转录水平和转录后水平上对靶基因的表达进行调控[5-6]。然而，作为分子链更长、结构更为复杂、量更多的lncRNA的研究才刚起步。关于这类基因中“暗物质”的研究却已在近年来取得了一定的发展。

据世界卫生组织( WHO)调查，育龄夫妇中约 15% 存在不育问题，而发展中国家某些地区可高达 30%,其中有50%以上的因素是由男方因素导致的[7]。近年来，不育己俨然成为困扰全球范围无数育龄家庭的严峻问题，加上环境食品安全、电磁波辐射、生活情绪压力增大的影响，人类生殖能力出现下降趋势，不育症发病率将随之提高[8]。虽然现代诸如“试管”婴儿(ICSI:卵母细胞胞浆内单精子注射)等的辅助生殖技术为己知病因的男性不育患者带来一定期望，但是仍然有很多男性不育患者病因并不明确(如：非梗阻性无精症)，为临床治疗带来很大瓶颈[9]。

正常男性每天产生超过一亿精子，每一个成熟精子生成都是由一个称为精子发生的复杂调控过程完成的。精子发生(spermatogenesis)是一个复杂且受到精确调控的生殖细胞增殖、分化过程，涉及多种基因的调控、染色体重构及其他多种因素的共同作用[10]。哺乳动物精子发生过程中圆形精子发生阶段转录停滞，生殖细胞复杂的转录子包括mRNA,非编码RNA生成，进行基因转录后水平的调控。研究结果表明，一些 lncRNA 与胚胎干细胞、诱导多能干细胞、精原干细胞等重要干细胞的增殖分化和自我更新过程关系密切(例如：HOTAIRM1 lncRNA等)，也参与了调控细胞周期，细胞凋亡等过程，并在抑制肿瘤(包括：乳腺癌、卵巢癌等)过程中发挥重要作用[11-14]。评估男性生育能力的主要分子学方法(包括：精子DNA损伤、精浆游离miRNA、精子线粒体基因变异和缺失等)为不育症病因分析领域起到了一定作用。最近几年来，长链非编码RNA作为转录组中的重要成员，在精子发生以及相关疾病中的作用被不断发现，引起越来越多的关注[15]，如前所述，长链RNA分子在肿瘤、动物发育等领域均起着重要的作用[11-14]，同样它在男性生殖方面也显示出良好的应用效能和前景。

本文主要初步综述了 lncRNA 的来源、分类标准、作用机制、结构预测及相关研究方法、LncRNA与男性不育等，为更好地理解和研究 lncRNA 在生物体内的作用提供参考。

一、LncRNA概述及作用机制

在分子生物学的中心法则中，DNA储存稳定遗传信息，蛋白质行使遗传信息的生物学功能，而RNA的主要功能是在蛋白质和基因间起媒介作用。实际情况，整个基因组仅2%可翻译成蛋白转录产物。大量的转录基因并不编码蛋白质，这些转录物被称为非编码RNA LncRNA。LncRNA生物来源广泛，可粗略划分为 5 类[16-17]：(I) lncRNA 中相邻重复单元结构由串联复制产生；(II)染色体重组过程中，由多个未转录且彼此分开的基因序列并置重组产生；(III)在逆转录过程中，由非编基因复制产生；(IV)由蛋白质编码基因框架结构断裂产生；(V)直接由转座因子插入产生。

随着新一代高通量测序技术的应用和发展，生物体内成千上万的lncRNAs在近几年不断被发现，关于lncRNA的生物学分类标准也随之不断更新发展，目前 lncRNA 的分类并没有统一的标准。

1.根据转录物长分为5类：(I)lncRNA；(II) 位于基因间区的超长链非编码RNA(very long- integenic noncoding RNA)；(III) 基因间区 长 链 非 编 码 RNA(long- integenic noncodingRNA,lincRNA)；(IV) 宏RNA(macro RNA)；(V) 与启动子相关联的 lnc paRNA(promoter- associated long RNA)。

2.根据与蛋白质编码 RNA 的相似程度可分为 mlncRNA 和 lin-cRNA。

3.根据其生物学功能可分为 4 类：(I) 作为mi RNA初级转录本的 lncRNA； (II) 具有增强子作用的lncRNA；(III)作为 pi RNA 初级转录本的 lncRNA；(IV)竞争性内源 RNA 。起初 lncRNA 被认为是基因组转录的“噪音”，是 PolⅡ转录的副产物，不具备任何生物学功能[18-19]。

近年来lncRNA在表观遗传学水平通过DNA甲基化或去甲基化，RNA干扰，组蛋白修饰，染色质重构等表达，在精子发生及受精过程等生殖过程中起了重要的作用[20-27]。不仅如此，有些 lncRNA 还可作为某些功能性 sn-cRNA，如microRNA 、siRNA和 piwiRNA 等的前体物 质 间 接 参 与 靶 基 因 的 调 控[27]。此外，lncRNA 不仅在表达方式上具有极强的时空特异性[28]在生物体内，lncRNA 主要通过 4 种方式行使其生物学功能[29]：(I)招募染色质修饰相关酶，并指导该蛋白复合物顺式或反式定位到调控位点(引导分子的方式)；(II)直接与转录因子、蛋白质分子等相关物质结合，阻断其对靶基因的作用，间接调控目标基因的转录(诱饵分子的方式)；(III)通过识别转录因子在信号通路中的联合作用来调控靶基因的表达(信号分子的方式)；(IV)作为中央平台招募多种蛋白质分子并形成核糖核蛋白复合物，通过影响组蛋白修饰在表观遗传水平上对靶基因进行调控(支架分子的方式)。

此外，一些lncRNA 在作用方式上还具有多样性，可同时以信号分子、诱饵分子、引导分子、支架分子中的多种方式参与基因的表达调控，例如由同源异型框基因 C(homeoboxC,HOXC)转录产生的同源异型框基因反义基因间RNA (HOX antisense intergenic RNA,HOTAIR)在多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2,PRC2) 和赖氨酸特异性脱甲基酶 1(lysine- specificdemethylase 1,LSD1)/转录因子沉默元件 1 辅阻遏物(corepressor for repressor element-1 silencing transcription factor,Co REST)/转录因子沉默元件 1(repressor element- 1 silencing transcription factor,REST)复合体的招募过程中发挥着支架分子作用，而在指导PRC2靶向作用于HOXD相应基因位点时又充当引导分子的角色。与 mRNA 不同，lncRNA 在一级序列上几乎没有保守性，但lncRNA的一些局部序列，如启动子区域附近和剪切位点序列保守性却很强[30]。使得大量 lncRNA 拥有高度保守的二级、三级结构，这些高度保守的结构对其生物学功能的发挥起着决定性作用。

二、 lnc RNA与雄性生殖

1.表观遗传与雄性生殖

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，是强烈的参与基因表达的生理控制，在基因表达调控精子发生过程起着举足轻重的作用[31],在哺乳动物，DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。有研究发现，DNA甲基化影响基因的表达，进而影响男性生殖器官的发育、精子的形成和男性性行为，这表明DNA甲基化的异常可能诱导男性发育及生殖功能的改变。H19基因属于人类发育印迹基因，为目前公认的LncRNA，不表达蛋白质产物。2013年李建波等通过染色体核型分析和Y染色体微缺失检测排除染色体因素干扰筛选出18例单一因素少精子症患者研究结果显示:CTCF6位点的DNA甲基化状态,少精子症患者的DNA甲基化丢失程度(2.67±0.75)%显著高于对照组(0.05±0.03)%和弱精子症组(0.03±0.02)% ，在少精子症男性不育患者中，印迹基因H19印记控制区域DNA甲基化的丢失明显，而且其精子浓度越低，甲基化丢失程度越高，且与精子活力无关[32]。

组蛋白修饰影响染色质的结构与功能，通过多种修饰方式的组合发挥其调控功能。组蛋白的各种修饰方式存在协同或拮抗的关系。组蛋白的甲基化由甲基化转移酶介导，赖氨酸残基可以发生单甲基化、二甲基化或三甲基化，精氨酸或赖氨酸的甲基化参与了精子发生过程中基因转录的激活或抑制，直接或间接影响精子的发生。精子发生过程中这两种酶所催化的H3和H4上赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化在精子发生过程中起了重要的调控作用。组蛋白的磷酸化通常与基因激活有关。组蛋白变体H2AX的磷酸化(也称为RH2AX)在精子发生过程中与减数分裂期间的基因沉默有关。2013年邱小波等研宄发现，在精子发生和体细胞 DNA 损伤修复过程中，组蛋白均会降解，修正了科学界关于体细胞组蛋白不降解的理论。在精子发生过程中，单倍体基因组中约96%的组蛋白最终都会丢失，只有4%的组蛋白将其所载表观遗传信息传给了下一代。精子中组蛋白的选择性降解可能有利于清除可导致疾病的表观遗传印记，并避免清除父代获得的、有益的表观遗传印记。其第一次揭示组织特异性蛋白酶体的存在，发现哺乳动物睾丸中的多数蛋白酶体(被命名为“生精蛋白酶体”)包含一个特殊激活因子，一个精细胞和精子特异的且与激活因子相邻的新亚基及三个特殊的催化亚基。 正是这一睾丸特异性蛋白酶体负责精子发生过程中依赖于乙酰化的组蛋白降解[33]。

最近研究者在雄性生殖细胞发育过程中的实验结果表明lncRNAs表达受到动态调控，其能通过遗传和表观遗传两种机制，在转录和转录后两个水平调控基因表达。具体采用Arraystar Mouse LncRNA芯片对6个时间关键点的lncRNA和mRNA表达进行分析(每个时间点取3对哺乳动物睾丸)结果发现均有成百的lincRNA和上千的lncRNAs表达上调或下调。进一步研究发现被高度调控的lncRNAs与临近(<30 KB)mRNA基因簇的表达上调或下调高度相关[34]。

2.lnc RNA NEAT1、lnc RNA Mrhl与雄性生殖

精子发生过程涉及精原干细胞的命运决定，其通过定向分化产生精子，这个过程非常复杂，涉及很多相关基因的特异性和时序性表达〔比如在SSCs (spermatogonial stem cells)〕自我更新过程中起重要作用的Bcl6b、Etv5 等，与 SSCs 分化相关的基因Kit L、EPCAM)等。NEATl是一个长链非编码 RNA，其在小鼠中的转录本长度约 3.2 kb。目前NEAT1主要发现其参与旁斑(paraspeckle)结构的形成并且能与其他的蛋白质-RNA 复合体共同参与修饰和加工处理编码蛋白质基因的转录等生物学过程。2014年Junhui的研究结果表明NEAT1 在小鼠睾丸组织、GC-1 细胞系中均表达,注射慢病毒之后，干扰组的小鼠睾丸指数比对照组有增加，但是实验结果显示这种变化不显著；而干扰组有精子发生的曲细精管比例下降到 86%，小鼠睾丸中精子发生受到影响，表明 NEAT1 参与调控雄性小鼠的精子发生[26]。

Mrhl 是一个位于细胞核由小鼠基因组编码，并在睾丸表达，大小为 2.4 kb 单外显子 lncRNA[35]。Ganesan & Rao2008年的研究表明 MrhlRNA 可能通过 2种分子机制调控精子发生。一是通过 Drosha 分裂 Mrhl 形成一个 80 nt 的 RNA 中间体。证据表明这些 RNAs 都位于GC1 精原细胞系的细胞核内，暗示其与染色质可能存在互作的关系[36]。并且，第一个显示调节的 wnt 信号在调节哺乳动物精子发生过程中起着非常重要的作用[37]。其通过与 p68 互作在小鼠精原细胞的 wnt 信号中发挥负调控作用。在 GC-1 Spg 细胞系中敲低 Mrhl RNA的表达，能导致一些与细胞信号转导和细胞发育及分化相关基因表达的紊乱，这其中大多是 wnt 信号通路中的基因[13]。由于Wnt信号通路能够导致细胞分化，抑制细胞增殖，因此Mrhl在精原细胞的分裂和分化调控中发挥重要作用[38]。就目前而言，仍需要通过基因敲除动物模型来进一步研究lncRNA Mrhl 对精子发生的调控作用。

3.lnc RNA Hongr ES2、 lnc RNA NLC1-C与雄性生殖

临床上男性不育的常见原因之一是精子的成熟阻滞(maturation arrest，MA)。Hongr ES2 是 一 种来自于大鼠的5和9号染色体的转录物嵌合形成且表 达 于 附 睾长度为1588nt的特 异lncRNA。其表达起始于第一轮精子发生刚刚完成时，随后逐渐增高，到第450天左右时趋于稳定，时空特异性的表达对在精子成熟中起到了重要作用。基础实验中检测出Hongr ES2剪切后产生的mil-HongrES2下调CES7基因表达其表达产物在精子获能(capacitation)过程中具有重要作用[39]。有趣的现象是，细胞核中mil-Hongr ES2的含量很少，而其前体Hongr ES的含量却很多，表明核内可能存在一种未知的剪切抑制机制。进一步的实验表明，mil-Hongr ES2的过量表达也会引起细胞内酪氨酸的广泛磷酸化，而后者是与精子获能相关的信号级联激活的标志。因此，Hongr ES2可以调控精子的成熟过程[38]此外，通过整体酪氨酸磷酸化水平分析表明 mil-Hongr ES2 的过度表达会导致精子获能的弱化，这表明对于附睾中正常的精子成熟过程而言，内源性低水平表达的 Hongr ES2 具有关键的调控作用[40]。

NLC1-C(narcolepsy candidate-region 1 genes)是一种仅在精原细胞和早期精母细胞表达的基因间 lncRNA，主要表达于细胞质，其在精子的成熟阻滞(maturation arrest，MA)患者中的表达量降低，但在细胞核中的表达上调。微阵列分析技术可见健康对照者与 MA 患者的睾丸 lncRNA 表达谱之间存在明显差异。NLC1-C 在细胞质的过表达能够促进细胞增殖，若被敲除则细胞增殖受到抑制并加速凋亡。体外细胞试验表明，NLC1-C 能够与位于核仁素的 RBD 结构域结合共同抑制 mi R-320a 和 mi R-383 的转录，而 mi R-320a 和 mi R-383 在加工成熟后则能直接抑制 NLC1-C 的作用以此调节细胞的存活。由此细胞核内 NLC1-C 的高表达可以加强对 miR-320a 和 miR-383 的转录抑制，进而导致精原细胞和初级精母细胞的过度增殖和成熟阻滞[41]。

4.lncRNA可能多通过微调的方式调控全局基因表达

伴随高通量测序技术发展，构成真核生物基因组中的大量“暗物质”近几年在睾丸组织中呈现高度特异性lncRNA表达，提示lncRNA的功能机制在精子发生基础生命学过程具有一定意义。2016年高冠军以模式生物果蝇为代表(基因组强净化的遗传学模式生物)，在果蝇活体上的研究，很大程度上填充了功能性非编码 RNA在其活体水平所缺乏的遗传学证据。具体采用优化后的CRISPR技术进行了长链lncRNA活体功能研究，研究结果表明，通过对突变体雄性果蝇测试(精子发生发育、活力等)进行实验分析，发现1/3的lncRNA基因的缺失会导致精子发育异常。一部分测试的lncRNAs敲除果蝇均可通过易位转基因得以完全或部分修复，说明这些lncRNAs主要以反式(trans)发挥作用。基因表达谱显示，大部分功能性lncRNAs在精子发生中调控全局基因的表达。进化分析表明，与编码基因相比，lncRNAs演化更快，且具有更大功能重要性的lncRNAs处于不断的进化选择之下(具有较高的序列保守性)。另外，lncRNA可能多通过微调(fine-tune)的方式调控全局基因表达，这一点与蛋白编码基因的开关调控作用相区别，对雄性生殖细胞分化的发育产生积极意义[42]。

三、结论与展望

综上所述，越来越多的lncRNA被发现与精子发生紧密相关，并参与雄性生殖细胞增殖、分化的调控过程，与miRNA不同的是，大部分LncRNA物种间保守性差，这些LncRNA存在未知的功能需要进一步的探索，一个可能的解释是不保守LncRNA间存在共同的功能域验证。lncRNA：

1.在作用方式上具有多样性，以信号分子、诱饵分子、引导分子、支架分子，几种方式参与基因的表达调控，行使其生物学功能;

2.作为新发现的表观遗传调节形式，与生殖过程相关的LncRNA可能通过如组蛋白修饰、染色质重构等机制参与精子的发生和成熟等生殖生物学事件;

3.通过多种方式在不同水平调控基因表达(如：本文中表述的近年来研究的较多的几种lncRNA NEAT1、Mrhl,Hongr ES2、 NLC1-C)在精子发生这一精密调控的过程中构建了一个复杂的调控网络，这些功能和表达的基础研究为我们了解男性生育力提供了一定程度创新的视野。另外，lncRNA可能多通过微调的方式调控全局基因表达，这一点与蛋白编码基因的开关调控作用相区别，进而对雄性生殖细胞分化的发育产生积极意义。

总之，由于相应实验技术等限制，对这一领域需要进一步深入的研究探讨，特别是与生殖过程相关的LncRNA的发现并进一步诠释它们的功能显得更加重要。相信随着实验技术的不断发展(生物信息学技术、新一代测序技术的发展等、ontology 数据库和蛋白质 RNA 结合模型的应用)以及对不同lncRNA功能的进一步理解，lncRNA很有可能在雄性生殖系统疾病的诊断治疗中成为新的生物标记物或治疗靶点，进而为男性不育合适的治疗方式提供潜在工具。

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