基因表达载体相关问题解读及应用

安徽 吴 浩

基因表达载体相关问题解读及应用

安徽 吴 浩

基因工程操作的核心是构建基因表达载体，围绕该表达载体的考题很突出，如2009年安徽卷T30、2014年天津卷T8、2015年江苏卷T32。下面从不同角度对该表达载体进行解读。

1.基因表达载体的一般结构及各部分功能

基因表达载体的一般结构包括复制原点+目的基因（插入基因）+启动子+终止子+标记基因（抗生素抗性基因）等组成。

启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。启动子是复制原点附近的一段DNA，它和特定的物质（如激素）作用后，通过一系列复杂的正反馈机制，激活复制原点（复制原点通常被某些酶结合而不易解旋）。

终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段；终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。

复制原点处的A和T特别多，相对氢键少，不稳定，DNA容易解旋，因此易与引物结合，成为转录的起点或复制的起点。

抗生素抗性基因作为其标记基因。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。标记基因又称报告基因，抗生素抗性基因是其中的一种。

【例1】 （2009年安徽卷T31，节选）某种野生植物有紫花和白花两种表现型，已知紫花形成的生物化学途径是：

A和a、B和b是分别位于两对染色体上的等位基因，A对a、B对b为显性。基因型不同的两白花植株杂交，F1紫花∶白花=1∶1。若将F1紫花植株自交，所得F2植株中紫花∶白花=9∶7。

请回答：（5）紫花中的紫色物质是一种天然的优质色素，但由于B基因表达的酶较少，紫色物质含量较低。设想通过基因工程技术，采用重组的Ti质粒转移一段DNA进入细胞并且整合到染色体上，以促进B基因在花瓣细胞中的表达，提高紫色物质含量。下图是一个已插入外源DNA片段的重组Ti质粒载体结构模式图，请填出标号所示结构的名称：

①__________②__________③__________

【解析】（5）依题意，标号所示结构的名称：①是T-DNA，②是标记基因，③是复制原点

【答案】（5）①T-DNA ②标记基因 ③复制原点

2.基因表达载体中启动子、终止子的来源及特点

（1）如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。

（2）如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。

（3）特异性启动子。组织特异启动子又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。如乳房生物反应器生产药用蛋白时，使用的是该类基因。

【例2】（2012年安徽卷T31，节选）甲型血友病是由X染色体上的隐性基因导致的遗传病（H对h为显性）。图1中两个家系都有血友病发病史，Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一个性染色体组成是XXY的非血友病儿子（Ⅳ2），家系中的其他成员性染色体组成均正常。

图1

（5）利用转基因猪乳腺生物反应器可生产F8。要使乳腺细胞合成F8，构建表达载体时，必须将F8基因cDNA与猪乳腺蛋白基因的__________等调控组件重组在一起。F8基因cDNA可通过克隆筛选获得，该cDNA比染色体上的F8基因短，原因是该cDNA没有_________。

【解析】（5）要使乳腺细胞合成F8，构建表达载体时，必须将F8基因cDNA与猪乳腺蛋白基因的启动子和终止子等调控组件重组在一起。F8基因cDNA可通过克隆筛选获得，该cDNA比染色体上的F8基因短，原因是该cDNA没有内含子。

【答案】（5）启动子 内含子

3.标记基因是否为载体上固有结构

作为运载体必须具备以下几个特点：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。质粒是基因工程最常用的运载体，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是能够自主复制的很小的环状DNA分子。根据此分析可知：标记基因是质粒上固有的。但在实践中由于构建载体的目的不同，需要的标记基因也会不同，有的标记基因是需要另外加上的，如绿色荧光蛋白基因与目的基因做成融合基因，根据荧光蛋白的特性来确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位。如2009年安徽高考和广东理科基础卷中都涉及“绿色荧光蛋白基因”。

【例3】（2009年安徽卷T4）2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的作用是 （ ）

A 追踪目的基因在细胞内的复制过程

B 追踪目的基因插入到染色体上的位置

C 追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布

D 追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构

【解析】本题属于信息给予题（或叫材料背景题），考查获取信息、分析推理等能力。根据题干“将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光”这句话可知：绿色荧光蛋白基因不是目的基因，而是对目的基因进行标记。借助绿色荧光蛋白基因的表达来对目的基因表达产物进行追踪提示。

【答案】C

4.载体上标记基因的标记原理

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞。

【例4】（2016年全国卷ⅠT40，节选）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____________；并且____________和__________的细胞也是不能区分的，其原因是__________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_________的固体培养基。

【解析】（2）依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr）失活，而氨苄青霉素抗性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。

【答案】（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素

（作者单位：安徽省灵璧县灵璧一中）