高频正弦波振动抑制废用性肌萎缩的凋亡进程

石 磊, 汪一鸣, 胡婷华, 樊小力

高频正弦波振动抑制废用性肌萎缩的凋亡进程

石 磊1, 汪一鸣1, 胡婷华2, 樊小力3

目的：探讨高频正弦波振动(HFV)对骨骼肌在废用状态时细胞凋亡的对抗作用。方法：建立废用动物模型，改进振动仪的关键技术，采用短时间歇式振动的方法，结合电镜观察、免疫组化染色法和TUNEL法检测，观察HFV对制动大鼠比目鱼肌(SOL)湿重体重比、肌纤维横截面积、肌纤维超微结构的变化、Bcl-2和Bax的表达情况。结果：(1)制动后大鼠SOL湿重体重比为30.22±2.68,下降了36.43%。肌纤维的横截面积为3789.56±95.14μm2,下降了37.77%。HFV组相对制动组的SOL湿重体重比及横截面积均有所增加(P<0.05)；(2)电镜可见制动后梭外肌病变明显，核内染色质团块状凝集。梭内肌部分肌膜溶解消失，细胞核变形。振动组的梭外肌Z线结构比较清晰，梭内肌纤维结构未见明显改变；(3)制动后大鼠SOL中Bcl-2阳性表达率为20%，明显低于对照组的表达情况(P<0.05)。制动后Bax阳性表达率为80%，明显高于对照组的表达情况(P<0.05)。制动后AI为20%，明显高于对照组(P<0.05)。HFV组相对制动组的Bcl-2阳性表达率均有所增加，Bax阳性表达率以及AI有所降低(P<0.05)。结论：改进后的抗肌萎缩振动仪操作性较强，对制动大鼠废用性肌萎缩的凋亡进程有抑制作用。

高频正弦波振动；肌梭；废用性肌萎缩；凋亡；骨骼肌

肢体制动、运动减退或是宇航飞行后，骨骼肌的质量和生理功能会发生明显的退行性改变，对人体的技能提高和运动寿命乃至日常活动会产生深远的影响[1-2]。废用性肌萎缩是多种因素共同作用的结果，学者针对不同的发生机制理论进行了诸多对抗措施的研究,部分研究己深入到细胞分子层次。目前主要的临床干预措施有机械负荷训练、药物治疗、电刺激、营养补充等，最近，冬眠的松鼠已经被确定为研究抗萎缩的一种创新模式[3-9]。但由于缺乏在细胞和分子层面对诱发肌萎缩机制的统一认识，目前尚没有权威的有效治疗方法[10]。

细胞凋亡是一个主动的、高度有序的死亡过程，是机体生存和发育的基础，凋亡信号相关途径的改变会导致人类疾病[11-13]，在维持骨骼肌动态平衡中发挥重要作用。肌梭的传入放电减少是废用性肌萎缩发生的重要原因之一[14-17]。高频正弦波振动(HFV)可以选择性地兴奋肌梭[18-19]，有对抗废用性肌萎缩的作用，相对于上述治疗方式，具有无痛易行的优势。通过Web of sicense和中国期刊网查阅发现，目前有关HFV对骨骼肌在废用状态时细胞凋亡的研究尚未见报道。

为此，我们以大鼠后肢伸长位制动为废用动物模型，改进抗肌萎缩振动仪的关键技术，采用短时间歇式振动的方法，结合电镜观察、免疫组化染色法和TUNEL法检测，观察HFV对制动大鼠比目鱼肌(SOL)湿重体重比、肌纤维横截面积、超微结构的变化、Bcl-2和Bax的表达情况，探讨HFV对骨骼肌在废用状态时细胞凋亡的对抗作用，为寻找预防和治疗废用性肌萎缩的有效措施提供资料。

1 研究对象和方法

1.1 高频正弦波振动的发生装置

此次试验所采用的抗肌萎缩振动仪有别于目前市场各种传统的正弦机械振动发生装置(用线圈在匀磁场中的振动代替传统意义上的机械振动)，技术关键是通过数字电路控制线圈电流的频率和幅值(如图1)。电流控制主要通过一个数字电路和一个模拟电路来实现：(1)数字电路主要用51单片机 STC12C5A60S2控制芯片AD9833BR产生标准的正弦电压信号，旋钮调频和屏幕显示(如图2)；(2)模拟电路主要为一个简易电流源和功率放大电路模块，控制旋钮调幅和提供振动所需功率。

图1 系统原理框图

图2 单片机电路图

1.2 实验动物及分组

将健康雌性SD大鼠按体重配对原则分为5组(西安交大医学院实验动物中心提供，体重为230～240g，每组6只动物)：正常同步对照组(CON)，制动(IMM)14d组，制动+50Hz振动(IMM+50Hz HFV)14d 组，制动+100Hz振动(IMM+100Hz HFV)14d组，制动+200Hz振动(IMM+200Hz HFV)14d 组。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3 制动动物模型

应用传统模型并加以改进：将大鼠进行腹腔麻醉,在大鼠左后肢的弯曲部位(神经和血管较为密集且易受压位置)垫以棉层，最终用石膏绷带包扎动物后肢，将其固定在踝关节背伸(约45°)而膝关节伸展(约180°)位，使SOL处于伸长位。石膏绷带包扎时注意暴露出振动位点(见图3)。

图3 振动位置图

1.4 振动方法

在SOL肌腹部位采取短时多次的间歇式振动方法(高频正弦波振动仪器为自属专利产品)进行振动(50Hz、100Hz、200Hz，300um，14d)。每振动1min后间歇1min，重复4次后间歇2 min，此为1个振动周期，每回重复振动3个周期，每天进行4回振动。

1.5 检测方法

将大鼠进行腹腔麻醉，称体重后经升主动脉行血管灌注固定。灌注后立即取出大鼠左下肢SOL，称重并剪修肌肉(以100g体重标化计算SOL湿重体重比, MWW/BW)，电镜样品用戊二醛固定后交至西安交通大学电镜中心，免疫组化样品浸于多聚甲醛固定液(40 g/L，4℃)中过夜，以垂直位行石蜡包埋。

采用免疫组化检测Bcl-2和Bax的表达情况(参照传统ABC法进行免疫组化染色，anti-BCL-2，1:400；anti-BAX，1:200，Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA；阴性对照为PBS)。在显微镜下对10个随机视野中阳性细胞计数，染色强度所得分数分级如下：0，无染色；1，弱表达染色；2，中度表达染色；3，强表达染色。阳性细胞的百分比所得分数分级如下： 1 ，<25%；2，26%-50%；3，51%-75%；4，>76%。将上述两种评分值相加。根据总分值，样本被分为4组：阴性组，被染色的细胞在总细胞数中≤5%, 0分; 低表达组(+), 1-3 分；中等表达组(++), 4-5分；高表达组(+++), 6-7分。在这些分组中，阴性和低表达组被判定为该蛋白阴性表达，中等和高表达组被判定为该蛋白阳性表达。最终计算出Bcl-2和Bax的阳性表达率。 采用Gavrieli建立的TUNEL法标记骨骼肌凋亡的细胞核，阳性细胞核呈棕黄色且密集、固缩，单纯核棕黄色记为阴性。在400倍的光镜下,被观察的每张切片随机检测10个视野,计数每个视野凋亡的骨骼肌细胞数, 以凋亡阳性细胞数/总细胞数作为细胞凋亡指数(Apoptosis Index，AI)。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 HFV对制动大鼠SOL湿重及CSA的影响

大鼠行制动实验14 d后，SOL湿重体重比为30.22±2.68, 与CON组(47.54±3.97)对比有显著性差异(P<0.05)，下降了36.43%。CSA在制动14d后为3789.56±95.14)μm2, 与CON组(2367.98±81.45)μm2对比有显著性差异(P<0.05)，下降了37.77%。高频振作行动各组相对IMM组的SOL湿重体重比及CSA均有所增加，且差异显著(P<0.05)。其中IMM+100Hz组的效果更为明显。

表1 HFV对大鼠比目鱼肌湿重及CSA的影响

2.2 HFV对制动大鼠SOL超微结构的影响

图4 大鼠SOL肌纤维超微结构

透射电镜(TEM)下可见，CON组梭外肌结构清晰，肌节完整，Z线整齐，肌原纤维间线粒体结构清晰。肌梭结构完整、清晰，肌节完整，肌原纤维间可见较小的线粒体，线粒体圆形或杆状，线粒体嵴密集，结构清晰，神经髓鞘结构完整。制动14d后，梭外肌病变明显，肌节紊乱，部分肌原纤维消失，Z线呈水纹样病变，肌细胞核内染色质团块状凝集、边集，肌原纤维间线粒体轻度肿胀。肌卫星细胞数量增多，细胞核电子密度增加，体积缩小，核内常染色质丰富，核仁大而明显，肌浆网扩张，部分肌原纤维溶解区域被线粒体及其它细胞器充填。梭内肌部分肌膜溶解消失，细胞核变形，核膜部分溶解、中断，肌浆网扩张，轴周间隙增宽内囊壁部分肿胀溶解。高频振动组的梭外肌细胞轻度肿胀，肌原纤维排列略有紊乱，Z线结构比较清晰。梭内肌纤维结构虽有些疏松、水肿，但Z线排列整齐，肌原纤维结构完整，细胞核形态结构正常，神经末梢与轴周间隙未见明显改变(见图4)。

2.3 HFV对制动大鼠SOL细胞凋亡的影响

制动14d后大鼠SOL中Bcl-2阳性表达率为20%(2/10)，明显低于CON组的表达情况(9/10, 90%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。制动14d后Bax阳性表达率为80%(8/10)，明显高于CON组的表达情况(3/10, 30%，P<0.05)。制动14d后AI为20%，明显高于CON组的表达情况(3/10, 30%，P<0.05)。高频振动各组相对IMM组的Bcl-2阳性表达率均有所增加，Bax阳性表达率以及AI有所降低(P<0.05)，其中IMM+100Hz组的效果更为明显(见图4、5、6，表2)。制动14d后，肌梭中Bcl-2阳性表达有减少的趋势，Bax阳性表达有升高的趋势。在CON组肌梭中可见凋亡细胞核，IMM组凋亡细胞核明显增多，细胞肿胀(胞核也肿胀)明显。高频振动各组相对IMM组Bcl-2阳性表达有升高的趋势，Bax阳性表达有减少的趋势，凋亡细胞核明显减少(见图4、5、6)。

表2 HFV对大鼠SOL细胞凋亡的影响

图5 大鼠SOL Bcl-2染色

图6 大鼠SOL Bax染色

3 分析与讨论

3.1 对高频正弦波振动仪器所进行的技术改进

高频正弦波振动可提高肌梭的敏感性及传入放电，为此，我们以前期的自主产品“探头机箱式振动仪”(已获得专利)为基础，对正弦振动的发生装置进行了改造创新(专利申请中)，其主要发明创新有：①用线圈在匀磁场中的振动代替传统意义上的机械振动，实现摩擦小、耗能小、容易控制、可以微型化的目的；②小型电流源的设计，实现恒定正弦电流型号的输出，使线圈产生的动生电动势和感生电动势在线圈内产生的电流对输入电流基本无影响；③通过程序实现对芯片AD9833BR的控制产生正弦电压输出，继而控制电流输出，最终实现对机械振动的控制，也可通过改变程序实现其他形式的输出。

3.2 SOL湿重及肌纤维横截面积的变化

骨骼肌的质量和体积可以根据生理和病理条件而产生变化，肌萎缩的速度和程度具有很大的异质性，废用状态下慢肌萎缩较快肌明显，SOL和腓肠肌内侧肌萎缩速度最快[20-21]。因此，我们选取了大鼠SOL对湿重体重比和肌纤维横截面积进行了观察，结果发现制动后SOL出现了较大程度的萎缩。多数学者认为，肌萎缩的主要原因是由于废用状态下肌肉蛋白合成速率下降或/和分解速率上升导致，肌肉湿重及肌纤维横截面积的减少机制可归因于蛋白质降解增加与合成受阻。17d卧床致使小腿肌肉横截面积减少约8%，最大等长伸膝力矩下降6%；当卧床延长至38 d，小腿肌肉横截面积损失16%，最大等长伸膝力矩减少18%[22]。NaitoH等报道称失重期间蛋白质分解速率的上升及合成速率的下降并不是同期出现的，泛素蛋白酶系统和药依赖性蛋白酶体系统在肌萎缩中起着关键作用[23]。细胞凋亡是维持增殖组织完整性的必要条件[24]，凋亡细胞核可能促进了肌肉质量的减少，但其机制不甚明了[25]。

3.3 SOL超微结构的变化

细胞凋亡是多细胞生物中的一个重要生命过程，它确保消除多余的组织，维护组织平衡。细胞凋亡具有独特的生物化学过程和细胞形态学变化[26],有学者认为，电镜下凋亡细胞的形态特征(细胞骨架杂乱、细胞质和核浓缩、内质网腔膨胀、凋亡小体逐渐形成)仍然是确定细胞凋亡较为可靠的定性方法。本实验电镜观察可见细胞皱缩，核固缩、碎裂，动态膜皱缩和邻居或细胞外基质的粘附损失等比较典型的细胞凋亡特征，可以初步判断在废用状态下细胞凋亡的存在。有学者通过对头低位卧床休息30d的人体SOL电镜观察发现：SOL肌束状结构紊乱，Z线呈水纹样病变，肌细胞核内染色质团块状凝集、边集，肌纤维间间隙加大，偶尔可见肌纤维碎片，有呈病灶性表现的倾向，这与本次实验的结果比较一致。

3.4 肌肉萎缩与凋亡

骨骼肌细胞是多核细胞，机体对肌核数量有相当严格的调控。废用导致的肌萎缩往往会出现细胞核数量的损失，这种凋亡性核死亡与单核细胞的凋亡过程有所区别。多种应激因素促进了细胞的凋亡，过度训练可导致骨骼肌细胞发生凋亡，继而导致骨骼肌细胞的损伤，其机制可能是肌细胞抗肌萎缩蛋白缺乏所致[27]。同时，运动与活动减少时也会引起骨骼肌细胞的凋亡。细胞凋亡信号通路(死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路)的激活在废用性肌萎缩的发生发展中具有重要作用：死亡配体与细胞外受体结合后将凋亡信号转至胞内，活化Caspase-3引发DNA酶和核酸内切酶裂解基因组DNA并最终导致凋亡。这一过程发生在骨骼肌蛋白降解之前[28]。

Bcl-2 蛋白家族与凋亡密切相关(抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bfel、Al 等，促凋亡蛋白：Bax、Bcl-xS、Bad、Bak、Bik等)，它们分布在线粒体外膜、核膜和内质网膜上[29]。Bax可降低脂质双分子层的稳定性，启动Caspases的级联反应，导致染色质浓缩、核小体DNA片断化和凋亡小体的形成，促使细胞凋亡[30-32]。Bcl-2 则通过与 Bax竞争性地抑制结合，调控线粒体的渗透性，形成异源二聚体而抑制细胞凋亡。胞内Bcl- 2/Bax比值很大程度上决定了细胞是否接受诱导凋亡的信号，决定细胞存活或凋亡。

线粒体是凋亡的核心环节，可以放大外源性凋亡信号,当线粒体膜通透性发生改变后会释放细胞色素c和细胞凋亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor，AIF)从而引发凋亡[ 33]。此次试验显示，高频振动各组相对IMM组的Bcl-2阳性表达率均有所增加，Bax阳性表达率以及AI有所降低，推测高频振动因为兴奋了肌梭而改变了骨骼肌纤维的内环境，延缓了胞内线粒体的损失程度。最近的实验显示[34]：Bcl-2家族蛋白与 Ca2+信号有较强的相关，可以通过改变内质网的钙容量和Ca2+的释放速度实现间接对凋亡进展的调控。

3.5 肌梭的适应性变化

肌梭是骨骼肌内主要的感受牵拉刺激的感受器[35]，正常情况下，由于肌梭不断有传入冲动到达中枢，从而维持一定的肌紧张，并参与中枢对整个机体肌紧张的调节。然而，在运动减退、制动或肌肉去负荷等情况下，由于肌梭受到的刺激减少，向中枢传入的神经冲动也随之减少，随着废用时间的延长，进而会诱发有关中枢部位的变化，后者通过一系列复杂的神经、体液调节机制引起梭内肌与梭外肌代谢、结构或功能的改变，最终导致(或加重)肌肉萎缩。研究发现骨骼肌伸长位制动可减轻肌肉萎缩的程度,缩短位制动肌萎缩程度明显增加,间歇性牵拉及正弦波高频振动可有效防止肌萎缩, 更进一步证实了肌梭在废用状态下肌萎缩中的作用[36]。

正弦波振动可以选择性兴奋肌梭，使肌梭传入纤维，特别是初级传入纤维(Ⅰ类纤维)的传入冲动增加。因此我们认为：高频正弦波振动可抑制废用状态下大鼠比目鱼肌肌梭代谢与功能活动的改变，提高肌梭的敏感性及传入放电，从而反射性的引起肌紧张增强，改善梭外肌的代谢、功能和组织结构，因而具有对抗肌肉萎缩的作用。

4 研究结论

高频正弦波振动对废用性肌萎缩有对抗作用，可以延缓细胞凋亡进程，在临床上具有易操作和无创伤的优点，我们会进一步使之便携化和经济化，下一步工作将是对人体“可穿戴式抗肌萎缩仪”的研制。

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(编辑 孙君志)

High Frequency Sinusoidal Wave Vibration Inhibit Apoptosis of Disused Muscular Atrophy

SHI Lei1, WANG Yiming1, HU Tinghua2, FAN Xiaoli3

Objective: To investigate the antagonism of high-frequency sine-wave vibration (HFV) on the apoptosis of skeletal muscle in the disused state. Methods: The animal models were established and the key techniques of the vibration instrument were improved. The short-term intermittent vibration was used to observe the effects of HFV on soleus muscle (SOL) wet weight in the brains of SD rats. The ultrasonography, immunohistochemical staining TUNEL assay, the effect of HFV on the brake in rat soleus muscle (SOL) wet weight to body weight ratio, muscle fiber cross-sectional area, ultrastructural changes, Bcl-2 and Bax expression. Results 1) The body weight ratio of SOL was 30.22 ± 2.68, decreased by 36.43%. The cross-sectional area of muscle fiber was 3789.56 ± 95.14μm2, which decreased by 37.77%. (P<0.05). (2) Electron microscopy showed that the extraocular muscle lesion was obvious after the brachytherapy, and chromatin agglutination in the nucleus was observed in the HFV group compared with the brachytherapy group. Skeletal muscle part of the dissolution of the sarcolemma, nuclear deformation. (P<0.05), the Z-line structure of the extra-oculi muscle in the vibration group was clear, and no obvious change was observed in the intrafusal muscle fiber structure.3) The expression of Bcl-2 in the SOL was significantly lower than that in the control group <0.05). The positive rate of Bax expression was 80% after brakes, which was significantly higher than that of the control group (P<0.05). AI after braking was 20%, significantly higher than the control group (P<0.05). The expression of Bcl-2 and the expression of Bax and AI in the HFV group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). Conclusion The modified dystrophy vibrator has strong operability, which can restrain the process of apoptosis of the brake muscular atrophy.

highfrequencysinusoidalvibration;musclespindle;disuseatrophy;apoptosis;skeletalmuscle

G804.2 Document code：A Article ID：1001-9154(2017)02-0089-07

1.国家自然科学基金项目“从肌梭的改变探讨正弦波振动对抗废用性肌肉萎缩的作用机制”(30901583);2.中央高校基本科研业务费专项资金资助,西安交通大学基本科研业务费国际合作项目(1191320036)

石磊，博士，教授，研究方向：运动生理学，E-mail：shilei@xjtu.edu.cn。

1.西安交通大学体育中心，陕西 西安 710049；2.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710049；3.西安交通大学医学院，陕西 西安 710049 1.Xi’an Jiaotong University Sports Center，Xi’an Shanxi 710049; 2. First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University , Xi’an Shanxi 710049; 3. Department of Physiology, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an Shanxi 710049

2016-10-28

2017-01-06

G804.2

A

1001-9154(2017)02-0089-07