左乙拉西坦治疗癫痫模型大鼠痫性发作的疗效及可能机制

周艳辉 刘春苗 林 珍 王 琦 余 丹

(海口市人民医院神经内科，海南 海口 570208)

左乙拉西坦治疗癫痫模型大鼠痫性发作的疗效及可能机制

周艳辉 刘春苗 林 珍1王 琦1余 丹

(海口市人民医院神经内科，海南 海口 570208)

目的 探讨左乙拉西坦治疗癫痫模型大鼠痫性发作的疗效及作用机制。方法 将40只健康成年的Wistar大鼠按性别体重均衡随机分为空白对照组，模型组，甘珀酸组和左乙拉西坦组，每组10只。除空白对照组外，其余每组大鼠采用氯化锂-匹罗卡品建立癫痫大鼠模型，造模前甘珀酸组大鼠提前30 min给予甘珀酸20 mg/kg腹腔注射，左乙拉西坦组提前60 min给予左乙拉西坦0.3 g/kg灌胃，模型组大鼠给予等量的生理盐水。造模成功后持续监测脑电图，观察并记录各组大鼠首次痫性发作的时间以及造模后2、12、24 h发作时的行为表现次数，观察结束后取断头取脑，应用RT-PCR和Western印迹检测海马组织缝隙连接蛋白(Cx)43 mRNA和Cx43蛋白表达的变化。结果 与模型组比较，甘珀酸组和左乙拉西坦组大鼠脑电压均显著下降(P<0.01)；甘珀酸组和左乙拉西坦组大鼠脑电频率A和B均呈递增趋势，其中甘珀酸组大鼠脑电频率A和左乙拉西坦组大鼠脑电频率B变化显著(P<0.05)；与模型组比较，甘珀酸组和左乙拉西坦组大鼠癫痫发作潜伏期均明显延长(P<0.01)，且随着时间点的后延，各组大鼠痫性发作次数均逐渐减少，但与模型组比较，甘珀酸组和左乙拉西坦组减少均显著(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组大鼠比较，其余各组大鼠海马组织Cx43蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与模型组大鼠比较，甘珀酸组和左乙拉西坦组大鼠海马组织Cx43蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。与空白对照组大鼠比较，其余各组大鼠海马组织Cx43 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组大鼠比较，甘珀酸组和左乙拉西坦组大鼠海马组织Cx43 mRNA表达水平均显著下降(P<0.01)。结论 左乙拉西坦能有效控制癫痫大鼠的痫性发作，其机制可能与抑制大鼠海马组织Cx43的表达有关。

左乙拉西坦；癫痫；海马组织

癫痫是人体的大脑神经元因突发性异常放电而导致的大脑功能短暂性障碍，属慢性疾病，是人体发作性意识丧失的常见原因之一。部分癫痫患者伴有一定程度的认知功能障碍，但具体病因目前尚不清楚〔1〕。该病的治疗临床上主要以西药为主，但传统的抗癫痫药物副作用较大，本身易致患者出现认知功能损害〔2〕。甘珀酸具有广泛的缝隙连接阻断功能，是一种已知的有效抗癫痫药物；左乙拉西坦(LEV)属于吡咯烷酮类的新型抗癫痫药物。国内外研究表明，本品具有广谱、起效迅速、改善患者认知功能等特点，其作用不通过阻断离子通道或调节神经递质而实现，但具体作用机制尚不明确〔3〕。本文通过动物实验进一步观察LEV对癫痫大鼠痫性发作的疗效，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar大鼠，SPF级，雌雄兼用，体重180～220 g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，质量合格证编号：SCXK(陕)2015-0001-0001467；SPF级饲料(购于北京维通利华实验动物技术公司)喂养，自由饮水，适应性饲养3 d后进行相关实验，实验场所：西安交通大学医学院动物实验中心。

1.2 试剂与药品 氯化锂-匹罗卡品及甘珀酸，购于美国sigma-aldrich公司；二喹啉甲酸，购于比利时UCB Pharma S.A.公司。异氰硫酸荧光素(FITC)标记兔抗大鼠缝隙连接蛋白(Cx)43多克隆抗体，购于北京博奥森生物技术有限公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术有限公司)，PCR试剂盒、RT-PCR试剂盒(Qiagen公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司)。

1.3 主要仪器 ME-175E-W脑电图机(日本光电公司)，NT9216型脑电分析系统(北京新拓仪器研究所)。

1.4 实验分组及癫痫大鼠模型制备 将40只健康成年的Wistar大鼠按性别、体重均衡随机分为空白对照组，模型组，甘珀酸组和LEV组，每组10只。参照文献〔4〕并结合预实验，除空白对照组外(在各给药时间点给予等量的生理盐水)，其余各组大鼠先给予腹腔注射氯化锂120 mg/kg，间隔18～20 h后给予东莨菪碱1.5 mg/kg腹腔注射，30 min后再给予匹罗卡品80 mg/kg腹腔注射。在腹腔注射匹罗卡品前模型组不做特殊处理，甘珀酸组大鼠提前30 min给予腹腔注射甘珀酸20 mg/kg，LEV组大鼠提前60 min给予灌胃LEV 0.3 g/kg。模型成功与否的判断标准参照Racine分级〔5〕，如果出现Ⅲ级及以上发作，即可视为模型成功；未达到Ⅲ级大鼠继续注射氯化锂-匹罗卡品直至次数达到5次，5次后仍未达到标准的，视为造模不成功〔6〕，其中0级为无癫痫发作；Ⅰ级为面部阵挛、闭眼、须动、哈欠；Ⅱ级为在Ⅰ级基础上出现节律性点头、颈部肌肉抽动；Ⅲ级为在Ⅱ级基础上出现前肢或后肢单侧肢体抽动；Ⅳ级为在Ⅲ级基础上出现多肢抽动、痉挛并伴后肢站立；Ⅴ级为在Ⅳ级基础上出现全面性强直阵挛发作或跌倒。出现癫痫持续状态并持续发作1 h，给予地西泮腹腔注射止痉(10 mg/kg)。造模后各组大鼠均符合癫痫模型成功判定标准，造模成功。部分大鼠有追加注射氯化锂-匹罗卡品，各组追加动物数及追加次数：模型组2只大鼠分别追加1次和2次，甘珀酸组3只大鼠各追加1次，LEV组2只大鼠各追加2次。

1.5 检测方法及观察指标

1.5.1 脑电图及行为学观察〔7〕观察并记录各组大鼠首次痫性发作的时间，造模后2、12、24 h发作时的行为表现次数；同时，各组大鼠于造模成功后70 min开始监测清醒状态下10 min内的脑电图情况。测定前将大鼠固定在固定器(自制)中，以单极导联法在脑中线区两耳之间(顶中线区和Pz区)插入一针电极至皮层下，连接F3导电极线，左耳电极夹在左耳上，大鼠尾部以针电极接地。定标：50 μV/5 mm，时间常数：0.3 s，走纸速度：30 mm/s，滤波：30 Hz，增益：×1.0。脑电图监测采用NT9216型脑电分析系统中的平均参数功能，采用电压高低反映波幅的大小，以频率A分析δ、θ、α波，以频率B分析β波。

1.5.2 Western印迹法检测大鼠海马组织Cx43表达〔8〕观察24 h后将大鼠断头开颅取脑(在冰袋上进行)，称取海马组织100 mg，放入加有10 ml蛋白酶抑制剂的1 000 ml蛋白裂解液中低温4℃下充分匀浆，高速离心后可得胞膜蛋白及胞质。绘制标准曲线，采用BCA法测算Cx43蛋白浓度。变性后取100 mg进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，分离后取蛋白转至PVDF膜，用含有5%牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)封闭30 min，然后用含有1%BSA的PBS液按照1∶500比例稀释兔抗Cx43，4℃孵育过夜。羊抗兔IgG(1∶500)与ABC复合物在室温下反应1 h，然后用Vigor-12C图像扫描仪测灰度值。

1.5.3 RT-PCR法检测大鼠海马组织Cx43 mRNA表达〔9〕所有的操作均按照试剂盒说明的步骤进行，先称取4 mg逆转录成cDNA；取2 μl cDNA配成25 μl体系进行PCR扩增，反应程序条件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、30 s；72 ℃、10 min，4℃放置。PCR结束后每管加入6×上样缓冲液4 ml，充分混匀，取5 ml PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果用Quantity one软件分析灰度比值。Cx43上游引物：5'-TTA AGG AGA ACC-3'，下游引物：5'-CCC TCG TTG TTC-3'；β-actin上游引物：5'-GAA ATG ACC AT-3'，下游引物：5'-GCT TAA CAG GCC TA-3'。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 脑电图及行为学观察 通过监测脑电图可知，空白对照组大鼠脑电电压在13～30 mV之间，脑电频率由较少、基本无节律的α波、较多散发的β波和杂乱的θ波共同组成。与空白对照组比较，其余各组大鼠脑电电压显著升高(P<0.05)，脑电频率A呈减慢趋势(P<0.05)，脑电频率B亦呈减慢趋势(P<0.05)；与模型组比较，甘珀酸组和LEV组大鼠脑电电压均显著下降(P<0.01)，脑电频率A和B均呈递增趋势，其中甘珀酸组大鼠脑电频率A和LEV组大鼠脑电频率B变化显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脑电电压、脑电频率A、 脑电频率B的比较

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2 各组癫痫发作潜伏期及行为表现次数比较 除空白对照组外，其余各组大鼠均出现癫痫；与模型组比较，甘珀酸组和LEV组的大鼠癫痫发作潜伏期明显延长(P<0.01)。发作后2、12、24 h，随着时间点的后延，各组大鼠痫性发作次数均逐渐减少；与模型组比较，甘珀酸组和LEV组均显著性减少(P<0.05或P<0.01)；与甘珀酸组比较，LEV组减少更显著，但无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠痫性发作潜伏期、行为表现次数比较±s,n=10)

2.3 大鼠海马组织Cx43 mRNA及蛋白表达 与空白对照组大鼠比较，其余各组大鼠海马组织Cx43 mRNA蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组大鼠相比，甘珀酸组和LEV组大鼠海马组织Cx43 mRNA及蛋白表达水平均明显下降(P<0.05)，但两组间比较无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠海马组织Cx43蛋白、 Cx43 mRNA表达情况

3 讨 论

LEV属于吡咯烷类衍生物，口服给药具有不受食物影响，吸收迅速完全，生物利用度高，血浆蛋白结合率低，不经过肝脏代谢直接以原型由肾脏排泄〔10〕。关于LEV抗癫痫的作用机制文献报道较多，大量研究表明〔11〕，该药与其他抗癫痫药物作用机制不同，主要通过结合中枢神经内突触囊泡蛋白(SV2A)调节突触内囊泡的胞外分泌功能和突触前神经递质的释放。有研究指出〔12〕，癫痫患者脑内星形胶质细胞Cx 43表达呈上调趋势，且上调程度与致痫时间长短呈正相关。采用荧光标记的胶原纤维酸性蛋白(GFAP)及采用抗体标记的健康人海马组织研究表明，癫痫患者星形胶质细胞耦联的损害呈扩大趋势，星形胶质细胞表达增加，表明星形胶质细胞的上调会加重全面性癫痫发作〔13〕；而海人酸所致癫痫模型大鼠的大脑皮质与海马均呈阳性，并与致痫时间呈显著正相关，由此可知，星形胶质细胞参与了癫痫的发生及发展过程。也有学者提出，LEV抗癫痫作用机制可能与GABA受体敏感性有关；LEV可以通过有效阻断电压依赖性钠离子通道，降低癫痫样放电产生的电位数目，缩短放电持续时间，对钙离子通道有轻微的阻滞作用〔14〕。

有研究表明，甘珀酸能够通过阻断缝隙连接的电扩布网络而治疗癫痫。甘珀酸通过直接与Cx结合，使之结构发生改变而使通道关闭，对Cx产生阻断作用。药理学研究表明，甘珀酸可缩短癫痫大鼠痫性发作的持续时间，降低痫性放电幅度，具有较明确的抗癫痫作用。本研究选用甘珀酸干预癫痫大鼠有效，与上述结果相一致〔15〕。

本研究结果表明LEV能显著降低癫痫大鼠脑电电压、增加脑电频率、延长痫性发作潜伏期、减少痫性发作次数、抑制海马组织Cx43蛋白和mRNA表达，提示LEV对癫痫大鼠痫性发作有良好的预防和控制作用。因Cx43是神经元和星形胶质细胞间的主要缝隙连接蛋白之一，其表达增多可造成神经元和星形胶质细胞间电耦联活动增强进而诱发癫痫，故推测LEV控制癫痫机制可能与降低海马组织Cx43蛋白和mRNA表达水平有关。

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〔2016-02-20修回〕

(编辑 袁左鸣)

周艳辉(1980-)，女，硕士，副主任医师，主要从事脑血管病临床研究。

R749

A

1005-9202(2017)04-0836-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.022

1 海口市人民医院老年病科