miR-181a在脑缺血神经损伤与神经康复中的作用

汪 丽 王剑雄 胥方元

(西南医科大学附属医院康复医学科，四川 泸州 646000)

miR-181a在脑缺血神经损伤与神经康复中的作用

汪 丽 王剑雄 胥方元

(西南医科大学附属医院康复医学科，四川 泸州 646000)

目的 探讨miR-181a在脑缺血损伤与神经康复中的作用机制。方法 构建脑缺血大鼠模型和miR-181a过表达载体，通过尾静脉注射促进脑缺血大鼠脑组织中miR-181a的表达。RT-PCR检测24 h后脑组织miR-181a的表达水平。Tunel检测海马区细胞凋亡情况。对脑缺血大鼠模型进行神经功能评分。Western印迹检测大鼠脑组织中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6的表达水平。结果 脑缺血处理的大鼠缺血组、对照组、促进组的miR-181a水平均明显高于正常组，促进组高于对照组和缺血组(P<0.01)，对照组和缺血组无显著差异(P>0.05)。尾静脉注射的rAAV-miR-181a载体可以有效促进大鼠脑组织中miR-181a的表达。Tunel结果显示，促进组中脑组织海马区的阳性细胞比例高于对照组。促进脑缺血大鼠miR-181a的表达，脑组织中细胞凋亡率增高。促进组大鼠神经功能评分明显高于对照组(P<0.05)，大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.01)。结论 miR-181a在脑缺血组织中过表达，可以促进脑组织细胞凋亡和炎症的发生，加重神经损伤的严重程度。

miR-181a；脑缺血；神经损伤；凋亡

脑缺血与高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病等的发生有密切关系，脑缺血可发生于任何年龄阶段〔1〕。小分子RNA(miRNA)在人体内广泛表达，在胚胎系统、神经系统、心血管系统等多种组织器官中发挥重要作用〔2，3〕。有研究表明，miR-376b、miR-497、miR-210等多种miRNA参与脑缺血后的神经细胞凋亡〔4〕，但尚未见miR-181a与脑缺血中神经损伤的相关研究。本研究拟探究miR-181a在脑缺血神经损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SD雄性健康大鼠40只，体重220～240 g，购于西南医科大学动物实验中心。主要仪器及试剂：水浴锅(长沙基隆仪器仪表有限公司)，超净工作台(苏州尚田洁净技术有限公司)，PCR仪(赛飞(中国)有限公司)，显微镜(日本尼康)，流式细胞仪(杭州联科生物科技有限公司)，离心机(盐城市凯特实验仪器有限公司)，紫外分光光度计(江苏天瑞仪器股份有限公司)，PVDF膜(美国Sigma)，PBS(鼎国生物试剂有限公司)，反转录试剂盒(上海易利生物科技有限公司)，荧光定量PCR试剂盒(上海易利生物科技有限公司)，IL-6单克隆抗体(上海文渊阁生物科技有限公司)，IL-1β单克隆抗体(上海文渊阁生物科技有限公司)，TNF-α单克隆抗体(上海文渊阁生物科技有限公司)，β-actin单克隆抗体(上海文渊阁生物科技有限公司)，辣根过氧化物标记的二抗(上海文渊阁生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 miR-181a过表达载体构建及实验分组 准备腺病毒感染的HEK293细胞，利用磷酸钙将包装质粒和miR-181a cDNA载体质粒共同转染到细胞中，培养48 h后，1 000 r/min离心10 min，弃上清液。反复冻融细胞团块，细胞裂解液在55℃孵育30 min。1 000 r/min离心10 min，弃细胞碎片。纯化粗提物，测定病毒的滴度。40只健康雄性大鼠分为正常组、缺血组、对照组和促进组，其中对照组和促进组分别尾静脉注射对照质粒(rAAV-GFP)和miR-181a过表达载体(rAAV-miR-181a)。

1.2.2 脑缺血大鼠模型构建 用浓度为10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠四肢和头部固定。小心剪毛后，在颈部中线小心切开4 cm，将皮下组织钝性分开后，将颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)分离并暴露后，凝闭颈动脉的分叉处和甲状腺上的动脉发出的枕动脉，凝闭用电凝器操作。根据ICA找到翼腭动脉(PPA)后阻断血流，阻断血流用微动脉夹操作。凝闭ECA的远端并用1号线打结，同时阻断颈总动脉和ICA的血流。将ECA切断后，拴线从ECA、ICA插入到大脑动脉(MCA)从而阻断血流。结扎ECA后，清理血块，去掉动脉夹，将伤口缝合。其中正常组分离颈总动脉，不阻断血流不插入拴线。

1.2.3 RT-PCR检测大鼠脑组织中miR-181a水平 大鼠脑缺血损伤后24 h，麻醉后断头处死，取大鼠的脑组织剪碎。在研钵中加入液氮后，将剪碎的组织置于研钵中研磨，观察研磨成粉状后，取80 mg粉末至EP管中，在EP管中加入1 ml的Trizol裂解液，混合均匀后放置于室温下裂解5 min。在EP管中加入氯仿200 μl，上下剧烈摇动15 s，10 000 r/min，4℃离心5 min，吸取上层水相层至新的EP管中，用500 μl的异丙醇抽提RNA，上下温和颠倒10次，在室温下静置10 min，10 000 r/min离心10 min。弃上清液，加入浓度为75%的乙醇悬浮RNA沉淀，10 000 r/min，4℃离心15 min，弃上清液。将EP管放置于超净工作台风干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水悬浮，紫外分光光度计测定提取的RNA浓度。按照反转录试剂盒说明书操作步骤反转录合成miR-181a的cDNA，实时荧光定量PCR检测miR-181a的水平。

1.2.4 Tunel检测细胞凋亡 大鼠脑缺血损伤后24 h，麻醉后断头处死，制作石蜡包埋的脑组织海马区组织切片。将脑组织切片放置于二甲苯中浸泡2次，5 min/次。分别用100%、95%、90%、80%、70%的浓度梯度乙醇浸泡，每个浓度梯度浸泡3 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，4 min/次。加入Proteinase K溶液孵育30 min。用蒸馏水洗涤切片4次，3 min/次。取末端转移酶(TdT)缓冲液滴加至切片上，放置于室温下孵育5 min。取50 μl TdT酶缓冲液，放置于湿盒中，37℃孵育1 h。其中阴性对照组中加入不含有TdT的酶反应液。将切片放置于Tunel缓冲液中，在染色缸中加入反应终止缓冲液和洗涤缓冲液，37℃孵育30 min，用PBS洗涤组织切片后，取过氧化物酶标记的抗体滴加至切片上，放置于湿盒中，37℃孵育30 min。滴加PBS洗涤后，加入二氨基联苯胺(DAB)，用苏木素复染后，用自来水冲洗，浓度梯度酒精脱水，二甲苯透明2次，中性树胶封片后，显微镜下观察阳性细胞数量占总细胞数的比值。

1.2.5 神经功能评分 神经功能评分设置为0～4分，评分越高，说明神经损伤越严重。大鼠可以自主活动，无异常反应，未表现出神经功能损伤的症状计0分；大鼠左前爪不能完全伸展，有轻度神经损伤的计1分；观察大鼠在自由活动时，身体不由自主地向左侧转圈，存在中度神经功能损伤症状的计2分；大鼠在自主活动时，身体不由自主地向左侧倾斜，具有重度神经功能损伤的计3分；大鼠不具备自由活动能力，不能行走，丧失意识，有极重度神经功能损伤计4分。

1.2.6 Western印迹检测白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6的表达水平 大鼠脑缺血损伤后24 h，取大鼠脑组织，剪碎后放置于匀浆器中，在匀浆器中加入含有苯甲基磺酸氟(PMSF)储备液的裂解液，放置于冰上充分研磨，转移组织研磨液至EP管中，12 000 r/m，4℃离心10 min。吸取蛋白上清液至新EP管中，用紫外分光光度计检测蛋白浓度及纯度。取蛋白样品与loading buffer充分混合后，放置于100℃煮沸5 min。在蛋白胶上样孔中加入50 μl的蛋白样品，蛋白电泳初始电压为80 V，电泳30 min后观察溴酚蓝进入分离胶后，调整电压至120 V。电泳结束后取出蛋白凝胶，按照滤纸、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、蛋白凝胶、滤纸的顺序，4℃转膜过夜，转膜电压为90 V。取出PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭后，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，5 min/次，分别依次与一抗和二抗孵育后，在暗室中显影，曝光，分析蛋白表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差表示。

2 结 果

2.1 RT-PCR检测大鼠脑组织中miR-181a表达结果 脑缺血处理的大鼠缺血组(1.98±0.02)、对照组(2.01±0.04)、促进组(3.21±0.08)的miR-181a的水平均明显高于正常组(1.02±0.01)，促进组高于对照组和缺血组(均P<0.01)，对照组和缺血组无显著性差异(P>0.05)。尾静脉注射的rAAV-miR-181a载体可以有效促进大鼠脑组织中miR-181a的表达。见图1。

图1 RT-PCR检测各组大鼠脑组织中miR-181a表达水平

2.2 Tunel检测大鼠脑组织细胞凋亡结果 促进组中脑组织的阳性细胞比例(0.74±0.05)高于对照组(0.26±0.03)(P<0.01)。促进脑缺血大鼠miR-181a的表达，脑组织中细胞凋亡率增高。

2.3 神经功能评分结果 促进组的大鼠神经功能评分(3.69±0.24)明显高于对照组(2.43±0.16)(P<0.05)。大鼠中过表达miR-181a可以促进大鼠神经损伤的发生。

2.4 Western印迹检测IL-1β、TNF-α、IL-6的表达结果 促进组大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.01)。见图2，表1。

图2 脑缺血大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平

组别IL-1βTNF-αIL-6对照组0.09±0.010.12±0.020.15±0.04促进组0.26±0.031)0.32±0.041)0.42±0.051)

与对照组比较：1)P<0.01

3 讨 论

脑缺血是一种严重危害人类生命健康的脑血管疾病，主要是由于脑组织中血液供应不足引起的〔5〕。脑缺血发生于多种疾病中，与糖尿病、高血压、血小板减少密不可分。脑缺血伴随的神经损伤是脑缺血致病的重要因素。有研究表明，脑缺血引起的神经损伤与神经细胞的凋亡有关〔6〕。

miRNA发现于真核生物中，由20～25个核苷酸组成，是一类非编码的具有调控功能的RNA。miRNA没有开放阅读框(ORF)〔7〕。成熟的miRNA是由一系列复杂的核酸酶加工剪切而成〔8〕。将剪切后的RNA被组装到沉默复合体中，可以通过碱基互补作用与靶mRNA结合。miRNA可以阻止mRNA的翻译或者直接降解mRNA。一般情况下，miRNA与靶mRNA不能完全互补的时候，可以阻止相关蛋白质的表达〔9〕。miRNA如果可以完全与靶mRNA互补，就可以直接降解靶mRNA。随着人们对miRNA的不断研究，miRNA的功能也越来越受到重视。已经有研究证明，miRNA参与了细胞的生长和凋亡，与心脏的发育、胚胎发育、神经元的形成、癌症的发生等有密切关系〔10〕。miR-273调控线虫神经系统的发育，miR-196在哺乳动物四肢的发育中具有调控功能，miR-1参与心脏的发育。miR-143在癌细胞中低表达，抑制了癌细胞的凋亡。miRNA在脑缺血疾病中发挥重要作用〔11〕。

miR-181a是一种小分子RNA，在神经系统中存在表达。miR-181a是miR-181家族中的一个成员〔12〕。miR-181a由23个核苷酸组成。miR-181a可以促进B细胞分化，与T细胞表面受体有关〔13〕。此外，miR-181a还与血管的发育、肿瘤的转移、心律失常等有密切关系〔14〕。本研究结果显示，miR-181a在脑缺血大鼠脑组织中过度表达。为了进一步验证脑缺血大鼠脑组织中miR-181a在神经损伤中的作用，构建了过表达miR-181a的质粒。通过尾静脉注射，促进缺血大鼠脑组织中miR-181a的表达。经RT-PCR检测，过表达载体可以有效促进脑缺血大鼠脑组织中miR-181a的表达。

脑缺血发生的神经损伤中，神经元细胞的凋亡是造成神经损伤的重要原因。利用Tunel法检测脑缺血大鼠中细胞凋亡结果，提示过表达miR-181a可以促使脑缺血大鼠神经元细胞的凋亡。根据神经功能评分标准，对脑缺血大鼠的神经损伤进行评分。结果提示miR-181a可以加重大鼠脑缺血的神经损伤。Western印迹检测结果说明miR-181a可以促进脑缺血大鼠脑组织中炎症的发生。

综上所述，miR-181a在脑缺血大鼠脑组织中过表达。miR-181a加重脑缺血神经损伤，促进神经元细胞的凋亡。这为进一步研究miR-181a在脑组织神经损伤中的作用机制奠定了基础，为治疗脑缺血提供了新的思路。

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〔2016-06-22修回〕

(编辑 袁左鸣)

胥方元(1970-)，男，硕士，硕士生导师，主任医师，主要从事神经康复、骨科康复研究。

汪 丽(1987-)，女，医师，在读硕士，主要从事神经康复、骨科康复研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)04-0831-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.020