直链烷基苯磺酸钠对小鼠皮肤组织老化的促进作用

赵文红 张 雯 王金花 王开磊

(蚌埠医学院预防医学系，安徽 蚌埠 233030)

直链烷基苯磺酸钠对小鼠皮肤组织老化的促进作用

赵文红 张 雯 王金花 王开磊

(蚌埠医学院预防医学系，安徽 蚌埠 233030)

目的 探讨直链烷基苯磺酸钠(LAS)对小鼠皮肤组织衰老的影响。方法 将50只健康昆明种雄性小鼠，随机分成5组，每组10只。各组分别为正常对照组、LAS低、中、高剂量组(LAS 150、300、600 mg/L)及D-半乳糖衰老模型组。正常对照组及LAS各剂量组分别用蒸馏水及不同剂量的LAS涂抹小鼠的背部剃毛处，连续涂抹60 d，衰老模型组小鼠每日在颈背部皮下注射5%D-半乳糖，连续注射60 d。取涂抹部位皮肤进行Masson及β-半乳糖苷酶染色；检测皮肤匀浆中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性；测定皮肤组织中羟脯氨酸(Hyp)含量。结果 与正常对照组相比，LAS各剂量组及衰老模型组小鼠皮肤组织变薄，胶原纤维减少，纤维排列杂乱、松散、模糊；β-半乳糖苷酶表达程度明显增高；MDA含量明显增加(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性及Hyp含量均明显降低(P<0.01)。结论 LAS可促进小鼠皮肤组织的老化。

直链烷基苯磺酸钠；皮肤组织；老化

直链烷基苯磺酸钠(LAS)是目前最普遍使用的阴离子型表面活性剂，是家用洗涤用品中的主要去污成分〔1〕。LAS对人属低毒类物质，难以降解，但在生产与生活过程中长期接触可使机体产生复杂的综合性的不良反应，尤其是容易残留于水中，或在生产或生活过程中易于与人的皮肤接触。有报道〔2〕从事家务劳动的妇女频繁接触各类洗涤剂引起手部皮炎的发病率逐年上升，洗涤剂被称为危害女性健康的潜在“杀手”。有关洗涤剂对机体皮肤损伤的机制还不清楚，本研究以小鼠作为实验对象，观察小鼠皮肤连续涂抹不同剂量的LAS后，皮肤中与衰老有关的生化指标及组织病理学变化，并利用前人〔3〕的经验，对小鼠连续皮下注射D-半乳糖，建立小鼠亚急性皮肤衰老模型，与LAS涂抹组小鼠进行比较、分析，为探讨LAS对皮肤损伤、衰老的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 LAS、甲醛、二甲苯、石蜡，国产试剂均为分析纯，购自蚌埠医学院试剂公司；D-半乳糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、Masson染液及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。722 s型分光光度计；FA2004电子天平；DY89-I型电动玻璃匀浆机；超低温离心机(德国Eppendorf 公司)；YL3回转式切片机(上海仪表厂)；Synergy 2 型酶标仪(美国Biotek公司)；全自动高压灭菌器(日本三菱集团)。

1.2 实验动物 5～6周龄昆明种雄性小鼠50只，体重(24±1.0)g。购自安徽省实验动物中心，清洁级动物，动物批号：scxk(皖)2011-002。动物饲养温度(22±2)℃，相对湿度 65%，自由饮水进食。

1.3 实验方法

1.3.1 LAS及D-半乳糖剂量的确定 LAS剂量参考预实验结果及本实验室以往的实验资料〔4,5〕。参考相关资料〔6〕，利用D-半乳糖制备亚急性衰老小鼠模型，每日在小鼠颈背部皮下注射5%D-半乳糖25 ml/kg，持续60 d。

1.3.2 小鼠分组及处理 将50只雄性小鼠常规饲养1 w后随机分成5个组，每组10只，分别为正常对照组、LAS低、中、高剂量组(LAS 150、300、600 mg/L)及衰老模型组。正常对照组及LAS不同剂量组的处理：在每个小鼠的背部剃毛，面积约1.5 cm×1.5 cm，每天用蒸馏水及不同剂量的LAS涂抹剃毛处，连续涂抹60 d。在其过程中，小鼠毛发生出，及时剃除。衰老模型组小鼠每日在颈背部皮下注射5%D-半乳糖25 ml/kg，持续60 d。 各组小鼠每周称重1次，第61天将小鼠脱臼致死，取涂抹部位皮肤(衰老模型组小鼠背部剃毛并摘取相应部位皮肤)，去除皮下脂肪组织，用4℃生理盐水清洗，滤纸拭干，一部分固定用于组织切片，一部分用于皮肤匀浆，另外一部分用于测定羟脯氨酸(Hyp)含量。

1.3.3 皮肤组织切片Masson染色 按试剂盒说明，将皮肤组织石蜡切片经脱蜡、梯度入水及温热水漂洗后分别用核染液、浆染液、分色液及复染液染色、冲洗、封片后，置镜下观察。

1.3.4 皮肤组织衰老的β-半乳糖苷酶染色 按试剂盒说明，将皮肤组织石蜡切片经脱蜡及水化处理，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定20 min，用PBS液洗涤，加入染色工作液，37℃温箱孵育过夜，普通显微镜下观察。

1.3.5 皮肤组织匀浆制备及指标检测 取部分皮肤组织用剪刀剪碎，按1 g加9 ml生理盐水制成10%的匀浆，3 000 r/min将匀浆液离心10 min，取上清液。按试剂盒要求，检测小鼠皮肤组织匀浆中 MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.3.6 皮肤组织中Hyp检测 按试剂盒要求，准确称取小鼠皮肤组织80～100 g，剪碎，加6 mol/L HCl 1 ml,沸水浴水解5 h。水解液调pH值6.0～6.8，加双蒸水至10 ml，取4 ml稀释液用活性炭澄清混匀，离心后取1 ml作为检测用。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1 皮肤组织切片Masson染色结果 LAS中、高剂量组小鼠与正常对照组小鼠相比较，其表皮及真皮厚度明显变薄。正常对照组小鼠皮肤中胶原纤维致密、均匀排列，LAS高剂量组和衰老模型组小鼠，胶原纤维量染色呈浅蓝色，皮肤浅表部位，胶原纤维排列杂乱、松散、模糊，失去束状排列，胶原纤维量明显减少，见图1。

图1 各组皮肤切片Masson染色

2.2 皮肤组织衰老的β-半乳糖苷酶染色结果 老化细胞在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下生成蓝色产物，正常对照组小鼠皮肤中没有检测到β-半乳糖苷酶阳性细胞；LAS低、中剂量组小鼠皮肤中可发现有零星的蓝色颗粒即β-半乳糖苷酶阳性细胞散在分布；LAS高剂量组及衰老模型组小鼠皮肤切片中能检测到较多的阳性细胞，说明LAS能够促进小鼠皮肤组织的老化进程，见图2。

2.3 小鼠皮肤组织中氧化应激指标的变化 LAS不同剂量组及衰老模型组MDA含量均明显高于正常对照组，SOD及GSH-Px活性均低于正常对照组(P<0.01)；且随LAS剂量增加，MDA含量有增加趋势，而SOD及GSH-Px活性有降低的趋势(P<0.05，P<0.01)。衰老模型组MDA含量高于LAS低剂量组，低于LAS高剂量组(P<0.05，P<0.01)，与中剂量组之间无统计学意义(P>0.05)；衰老模型组SOD活性高于LAS中、高剂量组(P<0.01)，与低剂量组之间无统计学意义(P>0.05)；衰老模型组GSH-Px活性低于LAS低剂量组(P<0.01)，与LAS中、高剂量组之间无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4 各组小鼠皮肤组织中Hyp的变化 LAS不同剂量组及衰老模型组Hyp均明显低于正常对照组(P<0.01)；LAS各剂量组中，随LAS剂量的增加Hyp有逐渐降低的趋势(P<0.01)。衰老模型组低于LAS低、中剂量组(P<0.01)，与高剂量组之间无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图2 各组β-半乳糖苷酶染色(×400)

组别MDA(nmol/mgprot)T-SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)Hyp(μg/mg湿重)正常对照组4.16±0.23257.79±21.971185.15±58.840.38±0.04LAS低剂量组5.28±0.612)214.36±15.262)1129.42±85.471)0.30±0.032)LAS中剂量组5.92±0.662)3)203.65±10.502)969.06±49.352)4)0.26±0.022)4)LAS高剂量组6.70±0.502)4)5)183.70±10.262)4)6)914.88±54.042)4)0.17±0.022)4)6)衰老模型组5.97±0.682)3)7)219.94±15.892)5)7)944.11±75.532)4)0.18±0022)4)6)F/P值28.78/<0.0131.24/<0.0133.37/<0.0164.23/<0.01

与正常对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与LAS低剂量组比较:3)P<0.05，4)P<0.01；与LAS中剂量组比较:5)P<0.05，6)P<0.01；与LAS高剂量组比较：7)P<0.01

3 讨 论

β-半乳糖苷酶是一种鉴别细胞衰老标致酶〔7〕，随着衰老的发生，在皮肤中的含量会不断增加,β-半乳糖苷酶染色实验可用于直观鉴定皮肤细胞的衰老程度〔8〕。本结果说明了LAS与D-半乳糖相似，可促进皮肤细胞衰老的发生。本研究表明LAS可对小鼠皮肤组织造成氧化应激损伤，且随LAS浓度增加，氧化应激有增加趋势。与此结果相似，本实验室前期研究中观察到同剂量的LAS对小鼠灌胃60 d，能导致肝组织MDA含量增加，SOD及GSH-Px活性下降〔4〕，MDA含量增高及SOD、GSH-Px活性的降低是氧化应激损伤的主要指标，所以LAS通过氧化应激而产生对各组织的有害作用可能是其毒作用的主要机制之一。研究表明〔9,10〕，氧化损伤是人体组织衰老的重要机制之一，皮肤衰老与之密切相关。Hyp在胶原蛋白中较为稳定，约占13.4%，而胶原蛋白大多分布在结缔组织，是真皮的主要成分，通过铰链相互连接维持皮肤的韧性，随着皮肤的衰老，胶原含量减少，因此Hyp的含量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况，胶原含量的变化可提示皮肤老化程度〔11〕。D-半乳糖亚急性衰老模型被认为当前抗衰老研究的较好模型〔6〕，被广泛应用，即在一定时间内通过皮下连续注射D-半乳糖，导致细胞代谢紊乱，自由基堆积等呈现衰老状态，本文选择此方法制作皮肤衰老模型以便于对LAS的研究。通过与衰老模型比较发现，中、高剂量LAS的大多指标可达到D-半乳糖所致衰老模型的程度。本研究结果证实了LAS能促进小鼠皮肤老化。但皮肤老化是一复杂的多因素参与的过程，除了上述指标，应对影响衰老的其他因素作进一步探讨。

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〔2015-07-25修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2014A159)；安徽省高等学校预防医学特色专业基金资助项目(皖教高〔2011〕5号)

赵文红(1967-)，女，硕士，副教授，硕士生导师，主要从事营养毒理学研究。

R151

A

1005-9202(2017)04-0825-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.017