数字图像法测定养殖水中的孔雀石绿*

俞巧玲，袁金涛，陈艳萍，周全

(郑州大学公共卫生学院，郑州 450001)

数字图像法测定养殖水中的孔雀石绿*

俞巧玲，袁金涛，陈艳萍，周全

(郑州大学公共卫生学院，郑州 450001)

建立一种简单、可靠的养殖水可孔雀石绿的数字图像检测方法。以1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体富集水样品，再用手机拍照获取样品信息，最后用数字图像结合多层感知器神经网络定量分析孔雀石绿的含量。该法测定结果的相对标准偏差不大于6%（n=5），加标回收率为97.8%～103.0%。该方法可用于养殖水可孔雀石绿的含量测定。

孔雀石绿；数字图像法；多层感知器神经网络；渔业养殖水

孔雀石绿具有致突变、致畸和致癌作用［1］，多数国家已宣布禁止在水产养殖中使用孔雀石绿［2］。自从孔雀石绿被禁用后，水霉病的防治一直没有较好的替代药物，而水霉病是我国水产养殖中的一种常见病，可造成较大的损失，因此一些养殖户不得不用孔雀石绿去防治该病［3］。另外，在孔雀石绿被禁用前，一些养殖场已使用过孔雀石绿，而养殖水体与底泥中的孔雀石绿残留在较长一段时间内保持动态平衡，即残留在底泥中的孔雀石绿会少量释放到水体中，对养殖鱼类产生二次污染［4］。除渔业因使用孔雀石绿污染养殖水体外，作为一种工业染料，孔雀石绿还易通过工业废水的排放直接或间接地污染养殖水。因此建立检测养殖水体中孔雀石绿微量残留的方法具有重要意义［5-8］。

作为一项新兴检测技术，数字图像法已广泛应用于医学、交通、航空及军事等领域，而用于化学定量分析方面的研究还不多［9-11］。简单、便捷且易推广的养殖水体检测方法对养殖户和监测部门具有重要的现实意义。如今的数码相机和智能手机摄像头具有操作简单、拍摄效果良好等优点，但因其不能像分光光度计一样分光，从而限制了它在分析化学中的应用。但根据三基色(RGB)原理，各种颜色是由红、绿、蓝3色按照不同比例合成产生的，应用RGB原理提取溶液照片的红、绿、蓝三种基色的信息后，与神经网络等方法结合仍可以对测试对象进行分析定量［12］。笔者采用数字图像结合多层感知器神经网络(Multilayer Perceptron Neural Network，MLP NN)测定养殖水中的孔雀石绿，为孔雀石绿定量分析提供一种快速、简便、可靠的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

智能手机：红米3S型，小米科技有限责任公司；

台灯：KLT SB-519型，东莞快灵通卡西尼电子科技有限公司；

亚克力板：厚度为3 mm，乳白色；

分析天平：FA1204B型，上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；

玻璃比色皿：光程为1 cm；

Image J软件：美国国家健康研究所；

1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(［Hmim］BF4)：国药集团化学试剂有限公司；

六氟磷酸铵(NH4PF6)：国药集团化学试剂有限公司；

结晶紫：天津市众联精细化学品开发有限公司；

孔雀石绿：天津市致远化学试剂有限公司；

实验所用试剂均为分析纯；

实验用水为超纯水（Milli-Q超纯水系统制得）。

1.2 自制装置

以家用普通台灯排列整齐的LED阵列部分（6 cm×6 cm）为光源，在距LED阵列5 cm处放一块乳白色亚克力板，LED阵列与亚克力板之间用不透光纸板围成四壁，构成一个6 cm×6 cm×5 cm灯箱。玻璃比色皿紧贴亚克力板放置，手机距比色皿12 cm处用默认拍照参数拍照。

1.3 实验方法

取50 mL含一定量孔雀石绿标准溶液的样品或经过滤的待测样品，置于离心管中，加入300 μL［Hmim］BF4和0.65 g NH4PF6后充分振荡混匀，在转速为4 000 r／min、温度为5℃的离心机内离心10 min，弃去上清液后离子液体富集相用乙腈定容至0.5 mL，最后取澄清溶液于比色皿中，用手机拍照。

1.4 图像数据处理

为避免边缘部分干扰，截取溶液中心部分图像（20 px×20 px）提取RGB信息，用Image J软件读取每个样品在R，G和B三个颜色通道的信息，可获得三个矩阵（20 px×20 px），然后将每个矩阵展开为矢量（1 px×400 px），最后将三个颜色通道矢量按R，G，B顺序衍接成一个长矢量（1 px×1 200 px），并用主成分分析法提取主成分。

2 结果与讨论

2.1 数码成像三基色与孔雀石绿浓度关系

孔雀石绿的颜色随着其浓度增加而变化，且呈现一定的变化趋势。由于纯白色（R，G，B值均为255）背景光源获得较困难，采用数字处理扣除背景颜色的干扰，得到相对于0 μg／mL浓度各浓度溶液R，G，B 3种颜色的相对强度值，见图1。由图1可见，数码成像后的R，G，B相对强度值随孔雀石绿的质量浓度变化而变化，并呈现出一定的变化趋势，这表明R，G，B相对强度值可以反映孔雀石绿的浓度变化。

图1 不同浓度孔雀石绿3个颜色通道的相对强度变化

2.2 实验条件的优化

2.2.1 离子液体用量

当孔雀石绿含量较低时，对目标物进行富集是一个关键步骤。本实验采用亲水性离子液体［Hmim］BF4作为萃取剂，NH4PF6作为阴离子配对剂，在溶液中生成疏水性离子液体［Hmim］PF6，用［Hmim］PF6进行萃取。研究发现［Hmim］BF4和NH4PF6物质的量比为1∶3时萃取效果最佳，因此将［Hmim］BF4和NH4PF6物质的量比固定为1∶3。［Hmim］BF4的用量分别取200～400 μL，考查不同［Hmim］BF4用量时萃取液的吸光度，结果如图2。由图2可知，萃取液的吸光度随着［Hmim］BF4用量体积的增大而提高，当［Hmim］BF4的用量由300 μL提高到350 μL时，吸光度基本不变。因此本实验选择［Hmim］BF4的用量为300 μL。

图2 不同［Hmim］BF4用量时的吸光度

2.2.2 网络模型参数确定

以MLP NN建立一个3层的神经网络结构［13-14］，包括输入层、隐含层、输出层。

按前述图像处理方法，每个样品共采集400个数据点，这些数据中每个颜色通道都有400个数据点，冗余信息多，对收集的所有样本数据组成的矩阵进行主成分分析，发现前3个主成分的特征根贡献率已达95.3%，因此取前3个主成分作为MLP NN的输入数据，即输入层节点数为3。

隐藏层节点数在进行模型训练时确定。为了得到稳健的模型，将样本随机划分为训练集和验证集，其中15个样品为训练集样本，10个样品作为预测集。经参数优化后，隐含层数为1，其激活函数为hyperbolic tangent，输出层也为1层，激活函数为identity。学习算法采用gradient descent算法，误差函数使用sum of squares函数。经过多次计算，最终应用Fast Artifi cial Neural Network (FANN) library建立了一个结构为3-11-1的3层MLP NN模型［15］。

2.3 加标回收试验与比对试验

向5个不含孔雀石绿的空白养殖水样品中加入孔雀石绿标准溶液制成模拟样品，检测并计算孔雀石绿的加标回收率，每种浓度的加标样品溶液同时用手机和分光光度计分别重复测定5次，结果见表1。由表1可知，采用数字图像法测定单个样品的相对标准偏差为1.4%～6.0%（n=5）内，加标回收率为97.8%～103.0%。采用传统的分光光度计检测，测定结果的相对标准偏差为1.4%～6.9%（n=5），加标回收率为96.0%～101.3%（n=5）。经配对t检验，两种方法无统计学差异。

表1 模拟样品中孔雀石绿检测结果

2.4 检测范围、检出限和干扰物质

应用数字图像法，孔雀石绿纯溶液检测范围为0～20.0 μg／mL，当含有其它色素成分干扰时，检测范围会变窄。利用7个平行空白样本求得方法检出限为68.0 ng／mL。试验了另一种养殖中常用鱼药结晶紫对孔雀石绿测定结果的干扰，发现20倍浓度的结晶紫对孔雀石绿检测结果的影响小于5%。

3 结语

采用数字图像结合MLP NN法，建立了测定养殖水中孔雀石绿浓度的新方法。本方法采用智能手机获取样本信息，经过主成分分析后，前3个主成分就可代表样本的颜色信息，据此建立一个结构为3-11-1的3层MLP NN模型，该模型对加标样本回收率达到97.8%～103.0%。上述结果表明，数字图像法结合主成分分析和MLP NN测定养殖水中的孔雀石绿简便可行，为孔雀石绿的简便快速检测提供了新思路。

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Determination of Malachite Green in Fishing Water by Digital Image Analysis

Yu Qiaoling, Yuan Jintao, Chen Yanping, Zhou Quan
(College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)

A simple and stable method for determing malachite green in fishing water was established based on digital image analysis. The fishing water samples were pretreated by ionic liquid of 1-hexyl-3-methyl-imidazolium tetrafluoroborate, and then the sample information was detected from the image taken by cell phone. The concentration of malachite green was determined by digital image analysis and multilayer perceptron neural network. The relative standard deviation for fishing water samples by this method was not more than 6%(n=5), and the average recoveries were in the range of 97.8%-103.0%. This method was suitable for determination of malachite green in fishing water.

malachite green; digital image analysis; multilayer perceptron neural network; fishing water

O657.3

:A

:1008-6145(2017)02-0028-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.02.007

*郑州大学大学生创新创业训练计划项目

联系人：袁金涛；E-mail： jtyuan@zzu.edu.cn

2017-02-16