ING4基因在肿瘤细胞凋亡过程中的研究进展

张萌，伍季

(1.川北医学院；2.南充市中心医院泌尿外科，四川 南充 637000)

ING4基因在肿瘤细胞凋亡过程中的研究进展

张萌1，伍季2

(1.川北医学院；2.南充市中心医院泌尿外科，四川 南充 637000)

ING4(inhibitor of growth family member4)基因是近年来新发现的一种肿瘤抑制基因。作为抑癌基因家族的重要成员，其广泛参与基因调节转录、细胞周期、凋亡、细胞衰老、接触抑制、DNA修复、抑制血管生成、促进细胞自噬等多个过程，对肿瘤的进程和预后产生重要影响。肿瘤细胞的凋亡在肿瘤研究中处于热点话题。ING4基因在肿瘤细胞凋亡过程中具有重要作用，它可以通过调节线粒体依赖性途径和死亡受体途径诱导细胞凋亡，还可以通过调节凋亡基因参与肿瘤细胞的凋亡。

ING4基因；肿瘤细胞；凋亡

生长抑制因子蛋白家族(inhibitor of growth family，ING)被确定为肿瘤抑制因子已有10多年，其共有5个家族成员，分别为INGl ～ ING5[1-3]。这5个家族成员广泛参与基因调节转录、细胞周期、凋亡、细胞衰老、接触抑制、DNA修复、抑制血管生成、细胞转移、低氧等过程[4-5]。ING4 基因作为ING4家族中的重要组成成员，因其通过多种调节途径在抑制肿瘤生长、浸润、转移以及促进细胞凋亡等过程中发挥着重要作用，从发现至今，一直处于热点研究方向。众多实验表明ING4基因在许多肿瘤中如胶质瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、头颈部的鳞状上皮细胞癌、恶性黑色素瘤、肝细胞癌等中起抑制作用[6]。本文就ING4 基因与肿瘤细胞凋亡过程中的研究进展作一综述。

1 ING4基因

ING4基因为第二类肿瘤生长抑制因子家族的一员，是Shiseki[1]等在2003年发现并从人脑垂体中被分离出来。该基因定位于染色体12p13-31区域内，由8个外显子和7个内含子组成，基因跨距13 kb，Genebank中有一个编码248个氨基酸的mRNA转录本和一个编码249个氨基酸的mRNA转录本，造成两个转录本的不同的原因可能是由于ING4的不同剪切方式而形成。ING4基因编码的蛋白定位于细胞核内，在人类所有被检测到的组织中均有表达。

ING4基因编码蛋白的N端和C端与ING家族其他蛋白具有高度同源性，其C端是具有高度保守的植物同源结构域(plant homeodomain，PHD)和核定位信号(nuclear localization signal，NIS)区[7]。PHD是广泛存在于植物或动物的转录调节蛋白中的磷脂酰肌醇磷酸的核受体，通过与磷脂酰肌醇磷酸信号分子相结合能够发挥调节细胞存活、细胞成熟、DNA修复、生长与增殖的作用。ING4蛋白通过PHD促进细胞凋亡的机制可能是：一方面是乙酰化组蛋白H4的多个赖氨酸残基，从而改变染色体的空间结构；另一方面是PHD区与DNA或RNA结合则能起着调节转录的作用。ING4蛋白的NLS位于编码氨基酸序列中段，含有127～167位氨基酸，具有多个含正电荷的赖氨酸，对ING4蛋白与p53在细胞核的复合定位中起着重要的作用。NLS不仅介导ING4的核定位以及IN4与p53在细胞核内的复合定位外[8]，而且在ING4与p53相互作用所诱导的p21表达上调中也扮演关键的角色。

随着对ING4的研究进一步深入，越来越多的研究表明，ING4具有的功能包括增强p53的活性、维持细胞间的接触性抑制、抑制肿瘤侵袭转移、抑制低氧诱导因子的活性、参与组蛋白乙酰化作用、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤新生血管的形成、影响细胞周期、促进细胞凋亡、促进细胞自噬及增强肿瘤对化疗药物的敏感性。

2 ING4与细胞凋亡的凋亡途径

2.1 ING4与细胞凋亡的线粒体依赖性途径

线粒体作为细胞器在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，线粒体内外膜之间的通透性转运孔(PT孔)的开启，使其膜的通透性增加及跨膜电位降低，从而释放细胞色素C、AIF、Smac和促凋亡因子等,并且细胞色素C能与Apaf-1及caspase-9形成复合体(凋亡小体)，在dATP、ATP存在下激活caspase-3，启动caspase级联，从而诱导细胞凋亡[9]。研究表明，Bcl-2家族蛋白质调节线粒体释放的cyct及其它程序化死亡蛋白[10]，而Bcl-2家族又受ING4调节。

Li等[11]通过运用FCM和TUNEL凋亡技术分析U87MG细胞中ING4基因的凋亡机制，他们认为ING4首先上调Bax的表达，降低Bcl-2的表达，然后促进细胞色素C从线粒体的释放，从而使caspase-3产生级联反应。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose)polymerase，PRAP]作为caspase-3主要的剪切对象，可以被其剪切成2个片段：a85-和a31-kDa剪切产物。被剪切的PRAP失去了DNA修复的功能和保持基因完整性的作用，细胞走向凋亡。Li等[6]认为Bax打开了线粒体电压依赖型阴离子通道，促凋亡基因Bcl-2可能参与了细胞色素C的释放和caspase-3的激活，诱导了线粒体凋亡途径。研究发现ING4基因在U-2OS细胞的过表达可以明显提高mRNA的表达和Bax的蛋白水平，从而使caspase-3被激活以此促进细胞凋亡。

2.2 ING4与细胞凋亡的死亡受体途径

死亡受体途径是由于Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子TNF-ɑ、TNF相关诱导凋亡的配体(TRAIL)与其位于细胞离子膜上的同源死亡受体相结合，受体被激活并触发引起凋亡蛋白的聚集，导致细胞凋亡，比如Fas相关死亡区域(Fas-associcted death domain protein，FADD)[12]。Fas属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族成员，它在分子结构上可以分为胞质区、跨膜区和膜外区。与之特异性相结合的天然配体(FasL)是属肿瘤坏死因子配体超家族成员[13]。FasL通过与Fas的结合使Fas相关死亡区域蛋白聚集到Fas胞质区中的死亡结构区域(death domain DD)。凭借胱氨酸蛋白酶原(Prcaspase)-8转变成活性caspase-8，使Prcaspase-8与FADD相结合从而形成死亡诱导信号复合体(the death-inducing signaling complex，DISC)，然后依次激活其他酶原如Prcaspase-3,6和7，最后导致细胞凋亡。另一方面，肿瘤细胞能够逃避免疫系统的攻击的重要机制之一就是通过Fas系统攻击自然杀伤细胞和细胞性毒性T淋巴细胞从而使肿瘤细胞逃避免疫监视，最后抑制肿瘤细胞凋亡[14]。

Li等[15]通过构建慢病毒载体把ING4转染至人类黑色素瘤A375细胞中发现ING4能够上调Fas、caspase-8、caspase-3的表达，下调FasL的表达，其结果表明ING4可能增强以依赖caspase-8途径的Fas系统诱导凋亡途径从而导致恶性黑素瘤细胞凋亡，并且ING4在黑色素瘤细胞的低表达及其功能的丢失使FasL在肿瘤细胞中高表达，从而帮助黑色素瘤细胞逃脱免疫监视，进而诱导T淋巴细胞的凋亡以及导致Fas表达的下降使黑色素瘤避免T淋巴细胞的攻击。Ling等[16]发现通过腺病毒把ING4转染至SPCA-1人类非小细胞腺肺癌中，通过免疫组化实验发现，Fas/FasL的表达上升。实验者进一步发现ING4能够增强Fas/FasL的表达，从而促进其下游分子如Caspase-8和Bid促凋亡蛋白的表达，最终激活凋亡的外源路径。

3 ING4与细胞凋亡的基因调控

3.1 ING4与p53基因

p53蛋白质是一种由p53基因编码的与细胞分裂周期相关的核磷酸蛋白质，分子量为53 ku。P53的重要功能是调节细胞周期和凋亡。它通过停止细胞生长和诱导细胞凋亡而发挥其肿瘤抑制的功能。ING4的羧基末端区域有能够重构核染色质和调节转录的PHD结构，ING4蛋白的NLS转录的氨基酸蛋白位于其中段，参与p53活化后的四聚化、细胞内定位及对调节p53蛋白转录[17]。Guo等[18]通过HPV16 E6干扰ING4对p53的稳定作用而抑制宫颈癌细胞凋亡发现ING4基因能通过其自身的NLS结构域与p53结合，所以NLS区域不仅是ING4基因亚核定位区域，也是与p53相结合的必备条件。另外，ING4与p53能够通过相互作用来增强p53蛋白活性和提高p53的甲基化[19]，如果改变ING4核定位或者NLS发生了突变，都会干扰ING4与p53的结合从而影响p53的功能[20]。ING4通过p53依赖途径诱导细胞凋亡的的机制是：提高p53基因的甲基化抑制Mdm2介导的p53基因降解提高p53下游基因在转录及转录后水平的表达。

3.2 ING4与Caspase家族

Caspase家族是属于半胱氨酸天冬氨酰特异性蛋白酶[21]。Caspase的激活在细胞凋亡发挥着主要作用。Caspase通常是由procaspase和非活性酶原形式存在。为了使细胞发生凋亡，procaspase必须被剪切或成为二聚体方能被活化。与凋亡有关的Caspase有两类：起始者Caspases (initiator caspases)如Caspase2、8、9、10和执行者Caspases( effector caspases)如Caspases3、6、7[22]。Caspase家族在凋亡中的细胞外(死亡受体)途径和胞内的线粒体途径中扮演着重要的作用。在死亡受体途径中，活化的受体经历空间结构的改变和通过与procaspase-8的死亡效应区域(death effect domain，DED)相结合来募集initiator procaspase-8到胞内死亡区域。这个过程就形成了一个被称为死亡诱导信号(DISC)的复合体。在DISC内，Caspase-8被剪切体所活化，然后触发effector procaspase-3，从而诱导细胞凋亡。在线粒体途径中，凋亡体的形成可以募集和活化initiator procaspase-9，由它剪切和活化effector procaspase-3，从而诱导细胞凋亡。所以在caspase家族中，caspase-3在诱导细胞凋亡过程中扮演者关键作用[23]。

Wu等[24]通过腺病毒把ING4转染至人类MDA-MB-231 乳腺癌细胞中，他们发现ING4会使剪切的caspase-9和剪切的caspase-3的表达上调，从而证明ING4引起凋亡与caspases家族是有关联的，并且他们认为活化的caspase-3引起细胞凋亡就可能表明ING4通过线粒体途径肿瘤细胞的凋亡。同时ING4引起caspase-3的高表达可以使活化的caspase-3剪切apolymerase-1蛋白(PARP)2个片段：a 85-和a 31-KD剪切产物。然后被剪切的PARP就失去了DNA修复和保持基因完整性的能力，最终就不可避免地导致细胞凋亡。

3.3 ING4与Bcl-2家族

Bcl-2家族在抗细胞凋亡和促细胞凋亡中发挥着重要的作用。促进细胞存活的亚科包括Bcl-2,Bcl-XL,Bcl-w,Mcl-1,和A1，而促进细胞凋亡的亚科根据BH结构域所拥有的数量则被分为多结构域组(Bax、Bak和Bok)和BH-3单独结构域组(Bid,Bim,Bad以及其它)。促进细胞存活的Bcl-2家族通过与多结构域的促细胞凋亡的Bcl-2家族成员相结合和抑制他们的凋亡活动，从而维持细胞的生存能力。这种相互的抑制作用是能够被BH-3单独结构域的成员所破解，BH-3单独结构域的成员被细胞凋亡的信号所激活，然后多结构域促进凋亡的成员就攻击线粒体，引起线粒体外膜的渗透性增加和凋亡。简单来说，促细胞凋亡的多结构成员扮演促凋亡的“刽子手”，而促凋亡的成员和BH-3单独结构域的成员分别扮演着凋亡的抑制作用和凋亡的启动/效应作用[25]。

Wei等[26]通过把ING4转染至MCF-7人类乳腺细胞癌中发现ING4基因的过表达可以使Bax的mRNA及蛋白水平相对上调。并且他们推测ING4与p53的结合不仅能调节转录活动而且可以调节p21和Bax的表达，同时认为Bax能够诱导凋亡的原因是打开了线粒体电压依赖型阴离子通道，从而导致细胞色素C的释放以及其它来自线粒体的促凋亡因子，然后使caspase激活，最后产生内在性凋亡路径。Cox-2作为前列腺素生物合成中的中心酶，对肿瘤的早期促进肿瘤细胞增殖，抗凋亡，血管增生，肿瘤细胞的浸润，对肿瘤细胞扩散做准备都起了关键性作用[26]，并且Cox-2可以通过上调Bcl-2的表达而抑制凋亡。Möbius等[27]实验发现，ING4转染至U87胶质瘤中可以显著降低Cox-2的表达，这就表明ING4促进凋亡可能下调Cox-2的合成，随后下调Bcl-2的合成。

3.4 ING4与Survivin家族

Survivin是一种细胞凋亡抑制基因，其主要作用包括调节有丝分裂、维持细胞存活，并可在转录水平抑制p53依赖性凋亡。细胞质Survivin 高表达可使线粒体释放的凋亡抑制蛋白抑制物失活，从而使放疗诱发释放的凋亡抑制蛋白抑制物不能发挥其有效作用，造成肿瘤细胞对放疗等产生耐受。Survivin基因抑制细胞凋亡的主要机制通过抑制肿瘤细胞中的不同caspases的活性或与外源性和内源性的凋亡途径的调节者相互作用以及或与细胞周期蛋白激活酶cdk34、p34和cdc2相互作用并敲除凋亡传导信号从而发挥抑制细胞凋亡的作用[28-29]。

Mao等[30]同样通过腺病毒把ING4转染至多耐药性SGC7901/CDDP胃癌细胞中，他们发现ING4可以下调Survivin的表达，从而引起肿瘤细胞的凋亡，并且在其缺少ING4的对照组中，Survivin mRNA的表达是上升的，所以在分子层面上，ING4是抑制Survivin的表达，从而促进凋亡的发生。同时这个研究结果，也在Wang等[31]把ING4通过腺病毒转染至人类CNE鼻咽癌中也得到了相应的证明。

4 结语

随着饮食、环境等的改变，肿瘤的发病率呈上升趋势，而现有的治疗方式对患者的生存率、治愈率的提高只在少数肿瘤中较为理想，如何寻找新的治疗方法以及如何提高肿瘤的早期诊断是目前大多数学者的关注热点。ING4 基因作为抑癌基因的重要成员，与肿瘤的关系十分密切，并且其在抑制凋亡过程的功能使其在恶性肿瘤的诊断及治疗中得到重视。但就目前国内外文献报道，ING4虽参与细胞凋亡途径的过程，具有诱导细胞凋亡的生物功能，但是其具体机制仍不清楚。我们相信随着对该基因研究的不断深入，可以预见，ING4基因将为恶性肿瘤的诊断及治疗带来新的希望与机遇。

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(学术编辑：何朗)

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The research of ING4 gene in the progress of tumor cell apoptosis

ZHANG Meng1,WU Ji2

(1.NorthSichuanMedicalCollege;2.DepartmentofUrologicSurgery,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

Inhbitor of growth family 4(ING4) is a novel tumor suppressor reported recently.As an important member of anti-oncogene family,it was involved in regulation of gene transcription,cell growth regulation, cell apoptosis,suppression of loss of contact inhibition,DNA repair,angiogenesis, promoting cell autophagy,which have a significant impact on the progression and prognosis of tumor.The tumor cell apoptosis is a hot topic in the tumor research.ING4 plays a critical role in the process of tumor cell apoptosis,which can induce apoptosis by mitochondria independent way and death receptor way,and can participate in tumor celll apoptosis through regulating apoptotic gene.

Inhbitor of growth factor 4;Tumor cell;Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.041

四川省教育厅(13EA0226)

2016-05-1907

张萌(1989-)，男，硕士研究生。E-mail：1129057161@qq.com

伍季，E-mail：wuji2168@qq.com

时间：2017-3-6 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2109.082.html

1005-3697(2017)01-0143-04

R730.5

A