不结球白菜活性物质的提取工艺及其抗氧化性

马景蕃++寇宗娟++刘喜明++钟丽娟++吴程

摘要：利用超声波法提取不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）中抗氧化活性物质，以抗氧化活性为指标，采用响应面法研究超声功率、超声时间、料液比、乙醇体积分数对产物抗氧化活性的影响。结果表明，在超声功率317 W、超声时间60 min、料液比1∶20（m∶V）、乙醇体积分数70%的条件下，产物抗氧化活性即Trolox浓度为59 076.4 μmol/L。产物对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子都具有清除作用，其IC50值分别为0.45、1.03、0.59 mg/mL。

关键词：不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）；超声波提取；抗氧化

中图分类号：S634.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0526-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.034

Optimization of Extraction of Bioactive Components from Non-heading Chinese Cabbage and Its Antioxidant Activity

MA Jing-fan1， KOU Zong-juan1， LIU Xi-ming2， ZHONG Li-juan1， WU Cheng1

（1.School of Life Sciences， Longyan University， Longyan 364012， Fujian，China；2.School of Art Design， Longyan University，

Longyan 364012， Fujian，China）

Abstract： Antioxidant substances was extracted from non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. chinensis Makino） in supersonic method. Regard the antioxidant activity as an index， the effects of supersonic power， supersonic time， solid-liquid ratio and ethanol concentration on the antioxidant activity were studied by the response surface analysis. The results showed that under the conditions of 317 W supersonic power， 60 min supersonic time， 1∶20（m∶V） solid-liquid ratio and 70% ethanol concentration，the concentration of Trolox was 59 076.4 μmol/L. Products had scavenging action to DPPH radical， hydroxyl radical， and superoxide anion. IC50 were 0.45 mg/mL， 1.03 mg/mL， and 0.59 mg/mL， respectively.

Key words： non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）； supersonic extraction； antioxidant activity

不結球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）是长江中下游地区主栽蔬菜品种之一[1]，中医认为不结球白菜微寒味甘，有养胃生津、除烦解渴、利尿通便、清热解毒的功效[2]。民间素有用带根不结球白菜120 g，加生姜、葱白各10 g，煨汤防治感冒与咳嗽[3]。近20多年来，国内外学者从不结球白菜中分离得到一系列复杂的化学成分，其中相当一部分具有生理活性[4]。研究发现，不结球白菜提取物抗氧化的效果好，尤以未完全成熟，叶形舒展的嫩株抗氧化效果尤佳[5]。在防癌食品排行榜中，不结球白菜排在大蒜后面，名列第二[6]。最新研究还发现，不结球白菜提取物能提升血液中雌激素代谢物-2羟雌酮的水平，对预防乳腺癌有益[7]。这说明不结球白菜不但可作为一种食品，同时又具有保健作用和药用价值。

响应面分析法（Response Surface Method，RSM）是一种优化工艺条件的有效方法[8]。以回归方程作为函数估算的工具，确定各因素及其交互作用对各指标的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，越来越多地应用于各种生物化工处理过程。本研究采用RSM法优化了不结球白菜活性物质的提取工艺，并对其抗氧化活性进行了评价，为不结球白菜的综合利用及产品的开发提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料

不结球白菜苏州青由龙岩学院生物技术课题组提供。采收后，用聚乙烯膜真空包装，迅速用液氮冷冻，真空冷冻干燥后粉碎过100目筛。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除 称取12.012 mg的Trolox标准品，用去离子水定容至200 mL。利用超声波将Trolox标准品充分溶解，得到浓度为240 μmol/L的Trolox标准品溶液，加入去离子水稀释后分别得到浓度为40、80、120、160、200 μmol/L 的Trolox标准品溶液。将质量为10 mg的 DPPH用甲醇定容至100 mL，将其稀释后得到浓度为20 mg/L的DPPH甲醇溶液。吸取10 μL的Trolox水溶液，加入990 μL的DPPH甲醇溶液，定容至4 mL，混合均匀，暗处避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度。根据试验结果，使用EXCEL软件的线性拟合功能绘制DPPH自由基清除Trolox的标准曲线，并得到线性回归方程[9]。

1.2.2 提取不结球白菜抗氧化活性物质的单因素试验

1）料液比。准确称取5.0 g不结球白菜粉，在乙醇体积分数70%，功率 400 W，提取时间40 min的条件下，分别考察1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30及1∶35（m∶V，下同）的料液比对不结球白菜抗氧化活性物质提取的影响。

2）超声时间。准确称取5.0 g不结球白菜粉，乙醇体积分数70%，功率400 W，料液比1∶20，考察30、40、50、60、70、80 min的不同超声时间对不结球白菜抗氧化活性物质提取的影响。

3）乙醇体积分数。准确称取5.0 g不结球白菜粉，功率400 W，料液比1∶20，超声时间60 min，考察40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇对不结球白菜抗氧化活性物质提取的影响。

4）超声波功率。准确称取5.0 g不结球白菜粉，乙醇体积分数70%，超声时间60 min，料液比1∶20，考察100、200、300、400、500、600 W的超聲功率对不结球白菜抗氧化活性物质提取的影响。

1.2.3 响应面试验 在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D），利用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken功能，以Trolox浓度为响应值，采用四因素三水平的响应面法优化不结球白菜抗氧化活性物质的提取条件，各因素和水平设计见表1。

1.2.4 不结球白菜活性物质的抗氧化性 DPPH自由基清除率的测定采用DPPH 95%乙醇体系法[10]；羟自由基清除率的测定采用二价铁离子测定法[11]；超氧阴离子自由基清除率的测定采用光照核黄素测定法[12]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

回归方程为Y=-0.000 5X+0.701，R2=0.998 3，表明Trolox浓度在0～1 000 μmol/L范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

由图1a可知，当料液比从1∶10到1∶20变化时，Trolox浓度显著增大（P<0.05），这时随着有机溶剂的量逐渐增多，促使越来越多的不结球白菜活性成分溶于其中[13]，但当料液比从1∶20到1∶35时， Trolox浓度变化不明显（P>0.05），这可能是因为当有机溶剂增加到一定程度时，不结球白菜中的活性物质大多已经溶解出来，再继续增加有机溶剂的含量对提取影响不大[14]，故料液比采用1∶20。

由图1b可知，当超声时间从30 min到60 min时，Trolox浓度呈显著上升趋势（P<0.05），说明随着超声时间的延长，超声波作用对不结球白菜细胞壁的效果增强，使其破碎更为彻底，其中的活性成分更容易被有机溶剂溶出。但当超声时间从60 min延长到80 min时，Trolox浓度上升幅度减小，且相邻两处理间差异不显著（P>0.05），这可能是不结球白菜活性成分的溶出已达到饱和。因此，超声波的最佳提取时间控制在60 min为宜。

从图1c可以看出，随着乙醇体积分数的逐渐增加，Trolox浓度呈显著增加的趋势（P<0.05），当乙醇体积分数为70%时，Trolox浓度最大；这说明较高体积分数的乙醇有利于不结球白菜活性成分的溶出。但当乙醇体积分数继续增大时，Trolox浓度呈下降趋势（P>0.05），这说明不结球白菜活性成分的溶出随着乙醇体积分数的增加没有明显的正相关关系。因此，可以得出最佳乙醇体积分数为70%。

从图1d可以看出，当超声功率从100 W增加到300 W的过程中，Trolox浓度显著增大（P<0.05），当超声功率达到300 W时，Trolox浓度达到最大值，但当超声功率从300 W继续增加到600 W时，Trolox浓度反而有所下降，可能是由于当超声功率增大到一定程度时，其对不结球白菜细胞壁的破碎程度达到最大，再继续增强超声功率就不会对Trolox浓度造成太大影响。因此，可以得出最佳超声功率为300 W。

2.3 响应面法优化不结球白菜活性物质提取工艺

2.3.1 响应面试验结果 以单因素试验结果为基础，利用Design-Expert 8.0.6软件优化不结球白菜活性物质的提取工艺，其设计方案及结果见表2。

利用Design-Expert 8.0.6统计软件对表2数据进行二次多项式回归分析[15]，得到Trolox浓度（Y）对因素A、B、C及D相应的二次方程模型：Y= 58 722.24 + 4 002.42A - 70.84B - 613.13C + 779.54D-203.45AB + 859.65AC - 573.10AD - 628.58BC-397.45 BD+388.23CD - 5 834.77A2 - 3 024.73B2 - 2 423.97C2 - 3 292.86D2。同时对表2中的数据进行多元回归分析，其结果见表3。

从表3中可以看出，回归模型达到极显著水平（P<0.01），说明模型预测值和实际值非常吻合，模型可靠。失拟项P>0.05，说明未知因素对试验结果影响较小。回归方程相关系数R2=0.990 0，显示响应值的变化99.00%来源于超声功率（A）、超声时间（B）、料液比（C）、和乙醇体积分数（D）4个变量。因此，回归方程具有较高的拟合度和可信度，说明回归方程与实际情况吻合较好，可用以推测真实试验的提取效果。其中，一次项A、C、D及二次项A2、B2、C2、D2对Trolox浓度的影响极显著。对回归方程中一次项系数的绝对值进行比较，可判断因子影响的主次性，结合方差分析结果，确定对Trolox浓度的影响从大到小的顺序依次为超声功率、乙醇体积分数、料液比、超声时间。

2.3.2 各因子交互作用對Trolox浓度的影响 在其他因素为零的水平上，利用软件选择超声功率、乙醇体积分数、料液比、超声时间4个变量中的2个交互因素对Trolox浓度的影响进行分析，回归优化得到相应的响应面及等高线图，其中显著交互项的响应曲面见图2。由图2可知，在一定范围内，Trolox浓度随超声功率和料液比的增大而增大，在交互作用等高线中，等高线沿A轴方向变化相对密集，说明超声功率对响应值峰值的影响大于料液比，这与回归分析结果相同。

2.3.3 最佳提取工艺及验证 结合回归模型的数学分析结果，不结球白菜活性物质的最佳提取工艺为超声功率316.73 W、超声时间59.89 min、料液比 1∶19.71、乙醇体积分数70.43%，此条件下Trolox浓度的预测值为59 444.7 μmol/L。考虑到实际操作的便利，将不结球白菜活性物质的最佳提取工艺参数调整为超声功率317 W、超声时间60 min、料液比 1∶20、乙醇体积分数70%，此条件下Trolox浓度的理论值为59 445.1 μmol/L。以最佳提取工艺条件，重复3次试验，得到Trolox浓度值为59 076.4 μmol/L。两者相比，相对误差约为0.62%，说明响应面法优化结果可靠。

2.4 不结球白菜提取物的抗氧化活性测定

2.4.1 提取物对DPPH自由基清除率的测定 根据响应面法最佳提取工艺制备不结球白菜的活性提取物，称取提取物干燥粉末，用去离子水分别配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，测定DPPH自由基清除率，结果见图3。由图3可知，随着不结球白菜提取物浓度的增大，对DPPH自由基的清除率也逐渐增大，当提取物的浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基清除率达到91%，IC50为0.45 mg/mL。

2.4.2 提取物对羟自由基清除率的测定 称取最佳提取工艺下制备的不结球白菜活性提取物干燥粉末，用去离子水分别配成1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL的溶液，测定其对羟自由基的清除率，结果见图4。由图4可知，随着不结球白菜提取物浓度的增大，对羟自由基的清除率也随之增大，当提取物的浓度为1.8 mg/mL时，羟自由基清除率达到了77%，IC50值为1.03 mg/mL。

2.4.3 提取物对超氧阴离子清除率的测定 称取最佳提取工艺下制备的不结球白菜活性提取物干燥粉末，用水分别配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液，测定提取物对超氧阴离子的清除率，结果见图5。由图5可知，随着提取物浓度的增大，对超氧阴离子的清除率也逐渐增大，当不结球白菜提取物的浓度为1.0 mg/mL时，超氧阴离子清除率为76%，IC50值为0.59 mg/mL。

3 小结

在单因素试验的基础上，用响应面法优化不结球白菜活性物质的超声波提取条件。结果表明，超声功率、料液比和乙醇体积分数对Trolox浓度的影响显著，超声功率与料液比交互作用对Trolox浓度影响显著。对Trolox浓度的影响从大到小的顺序依次为超声功率、乙醇体积分数、料液比、超声时间。优化后不结球白菜活性物质的最佳提取工艺为超声功率317 W、超声时间60 min、料液比1∶20、乙醇体积分数70%，此条件下Trolox浓度值为59 076.4 μmol/L，与预测值的相对误差为0.62%。

自由基是机体氧化反应中产生的有害物质，能够损害机体的细胞和组织，甚至引起衰老效应或者慢性疾病，本试验对最佳提取工艺下制备的不结球白菜活性提取物进行了抗氧化研究，其对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子都表现出较好的清除能力，IC50值分别为0.45、1.03、0.59 mg/mL。在试验浓度范围内，随着活性提取物浓度的增加，其清除自由基的活性增大。本研究为不结球白菜在医药和保健等方面的深入研究和应用提供参考和依据，而对于不结球白菜抗氧化活性成分的分离纯化还有待进一步研究。

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