自制改性碳纳米管分散固相萃取吸附剂—高效液相色谱法同时检测大米中4种黄曲霉毒素

袁 芹

(连云港职业技术学院，江苏 连云港 222006)

黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是一类由黄曲霉、寄生曲霉菌等多种霉菌产生,是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物,具有很强毒性，能严重破坏人和动物的肝脏组织，严重时会导致肝癌甚至死亡。世界上大多数国家和地区都规定其在食品中限量要求，并要求对黄曲霉毒素进行有效监管[1]。目前已经发现的黄曲霉毒素及其衍生物有20余种，天然产生的黄曲霉毒素根据其化学结构不同分为B1、B2、G1、G2四种(结构式见图1)。其中以AFB1的毒性最大。

食品中黄曲霉毒素的检测方法常见的有超临界流体萃取技术、加压流体萃取技术、固相萃取技术、免疫亲和层析技术等[2]。分散固相萃取法(dSPE)是近十年发展起来的新型样品前处理方法, 将净化吸附材料直接分散于待净化的提取液中, 吸附基质中的干扰成分,集萃取和净化于一身,具有操作简便高效、溶剂用量少、无需特殊设备等优点, 是一种绿色环保的样品前处理方法[3]。

碳纳米管(CNTs)与传统材料相比，具有比表面积大、化学性质稳定、吸附性能强等特点，近年来已被用于吸附材料[4-5]。但CNTs的水不溶性等理化性质又限制其应用。通过对CNTs修饰、改性以提高其性能。改性后CNTs管，由于其微结构发生变化，使CNTs管具有更优异的吸附特性[6]。我们前期的研究表明，碳纳米管经海藻酸钠改性后具有良好的分散性能和吸附性能[7,8]。目前对于利用改性碳纳米管作为dSPE净化吸附材料, 结合HPLC同时检测大米中4种黄曲霉毒素的相关报道较少。

本文采用自制的改性碳纳米管作为dSPE净化吸附材料，结合HPLC同时测定大米中的4种黄曲霉毒素，有效地消除了基质效应，建立的方法灵敏度高，为纳米技术在食品检测中的应用提供了依据。

图1 黄曲霉毒素的结构式Fig 1 Structures of AFT

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20 AT HPLC仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器(日本岛津公司)；BL6-180型高功率数控超声波清洗器(上海比朗仪器有限公司)；MS3 minishaker旋祸混匀器(IKA公司,德国)。

SAL-MWCNT-COOH(连云港职业技术学院自制)；AFB1、B2、G1、G2标准品(Sigma 公司,美国);甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；实验用水为去离子蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

大米样品:购于江苏省连云港市市场。

1.2 标准溶液配制

分别称取适量AFB1、B2、G1、G2标准品，用乙腈配制成100 mg/L的单标储备液，吸取适量单标储备液用乙腈稀释成不同浓度的混合标准系列工作液。以内标法定量。

1.3 样品前处理

称取适量大米样品磨碎，备用。称取5 g磨碎的大米样品于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入100 μg/L内标工作液100 μL，然后加入20 mL乙腈-水(80∶20，v/v)，涡旋混匀1 min，置超声波清洗器中超声提取10 min，再以5 000 r/min离心5 min，收集上清液至另一50 mL聚丙烯塑料离心管中。用纯净水稀释上清液至40 mL，混勻后取其中20 mL，加入适量SAL-MWCNTS-COOH，中速振荡提取2 min，以10 000 r/min离心2 min，弃去上清液，残余物中加入适量的乙酸乙酯，涡旋混勻1 min，以10 000 r/min离心2 min，上清液于40 ℃下氮气吹干，用乙腈-水(50∶50， v/v)溶解残余物，涡旋1 min后以8 000 r/min离心3 min，吸取上清液过0.22μm滤膜后供HPLC分析。

1.4 HPLC条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈和水；柱温：35 ℃，进样体积20 μL；流速：0.6 mL/min；梯度洗脱程序：0～7 min。

乙腈60%(体积分数，下同)，7～30 min乙腈60%线性升至90%；检测波长365 nm。

2 结果与讨论

2.1 dSPE条件的优化

2.1.1提取液浓度的优化

目前，黄曲霉毒素的提取方法主要以甲醇—水、乙腈—水为提取剂液。本文在参考文献[9～12]的基础上，选择乙腈—水作为提取液，比较了60、75、80、85、90%乙腈—水的提取效率，经过比较发现采用80%乙腈—水溶液对4种黄曲霉毒素提取效果总体最佳，均迗到93.5%以上的回收率，故选择80%乙腈—水溶液作为提取溶液。

2.1.2提取液pH值的影响

添加混合标准中间液(10 000 μg/L) 400 μL于20 mL空白大米样品提取液中，加水稀释至40 mL， SAL-MWCNT-COOH用量为200 mg，调节pH 值为3-10，T=25 ℃ ，按1.3所述进行操作，来考察提取液pH值对回收率的影响，结果见图2。

由图2可知， 4种黄曲霉毒素的吸附率在提取液pH值为7时回收率最大。这是由于黄曲霉毒素在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中，其内酯环开裂分解迅速，导致待测物与SAL-MWCNT-COOH吸附效率大大下降。因此，本实验选择提取液的pH值为7进行dSPE研究。

图2 提取液pH对回收率的影响Fig 2 Effect of pH on recovery

2.1.3SAL-MWCNT-COOH用量的影响

在提取液pH值为7，T=25 ℃ 条件下，SAL-MWCNT-COOH复合物对大米中黄曲霉毒素的回收率随其投加量的变化见图3。

图3 SAL-MWCNT-COOH用量对回收率的影响Fig 3 Effect of SAL-MWCNT-COOH on recovery

由图3可知，当SAL-MWCNT-COOH复合物的投加量在25～200 mg范围内时，吸附率随其投加量增大而急剧增加，这是由于吸附剂的量增多，增加了有效官能团和吸附的活性位点，当SAL-MWCNT-COOH复合物投加量为125 mg时，四种黄曲霉毒素的平均回收率达到92.5%，继续增大投加量，回收率变化不大。所以从经济角度考虑，并不是吸附剂量越大越好。

2.1.4洗脱液的选择

考虑到黄曲霉毒素的脂溶性，在上述优化后的最佳条件下进行洗脱剂选择试验，考察了甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等溶剂，结果发现以乙酸乙酯作洗脱剂时大米中四种黄曲霉毒素的回收率较高(图4)，故选择用乙酸乙酯作洗脱剂。

对乙酸乙酯进行体积优化，洗脱溶剂体积对回收率的影响见表1。从表1可看出，随着洗脱体积增多，四种黄曲霉毒素的洗脱回收率增大，当洗脱液体积为25 mL时，四种黄曲霉毒素未能被完全洗脱；当洗脱体积大于25 mL时，四种黄曲霉毒素的洗脱回收率变化不大，故本实验宜选择25 mL乙酸乙酯作为洗脱剂。

图4 不同洗脱液对回收率的影响Fig 4 Effect ofdifferent eluent on recovery

AF名称回收率/(%)5mL10mL15mL20mL25mL30mL35mLAFB175．3584．1386．7494．1496．5097．4598．13AFB270．1375．4482．4589．1792．0292．2393．57AFG169．2675．4780．3288．3691．6392．6692．66AFG257．9166．5972．3481．0590．1591．0191．23

2.2 色谱条件的优化

2.2.1检测波长

用紫外检测器对分离后的4种黄曲霉毒素标准溶液在200～400 nm 波长范围内进行扫描，根据仪器对不同黄曲霉毒素的响应信号强弱，实际大米样品中黄曲霉毒素残留的含量以及基线平稳状况，确定了检测波长为365 nm。

2.2.2流动相及流速

考察了甲醇一水和乙腈一水作为流动相的相对情况。结果表明，当以甲醇--水为流动相时，基线漂移严重，色谱出现拖尾现象；以乙腈—水为流动相时，基线稳定且4种黄曲霉毒素分离度能达到分析要求。在乙腈--水作为流动相的基础上考察了流速为0.4、0.6、0.8、1．0 mL/min时对4种黄曲霉毒素分离度的影响。当流速为0.6mL/min时，效果最好，故流速选择为0.6 mL/min。

2.3 方法的线性和检出限

将现有的4种黄曲霉毒素标准品配制成质量浓度为0.2、0.4、 1.0、 5.0、10.0、 20.0、 40.0、100.0、200.0μg/L9个水平的混合标准溶液，在优化条件进行测定，以标液的质量浓度(X，mg/L)与峰面积(y)作标准曲线，得到曲线的回归方程如表2所示，在0.2～200.0 μg/L线性范围内，线性关系良好。以1.0μg/L的混合标准溶液样品，按3倍信噪比计算，4种黄曲霉毒素的检出限为0.043、0.031、0.028、0.018μg/L；以10倍信噪比计算，其定量下限为0.142、0.103、0.090 2、0/073 μg/L。

表2 线性范围、线性方程、相关系数及方法的检出限Table 2 Linear ranges ,linear equation ,correlation coefficient(r) and limits of the method

2.4 方法的精密度和准确度

采用在空白样品中添加标准溶液的方法,对大米样品中4种黄曲霉毒素进行添加回收率试验,加标浓度为0.2～200.0 μg/kg，每个浓度平行进行6个水平分析，结果显示，4种黄曲霉毒素的加标回收率分别为84.6%～94.1%、80.3%～92.5%、82.7%～89.3%和81.8%～90.6%，精密度(RSD)位5.8～9.2%(见表3)。

2.5 实际样品检测

采用该方法对市售的新大米检测，均未查出4种黄曲霉毒素。

表3 添加回收率Table 3 The recoveries and precisions of aflatoxin Bl，B2，G1and G2 in spiked samples(n=6)

3结 论

本文采用自制的改性碳纳米管作为dSPE填料用于大米中黄曲霉毒素的dSPE- HPLC检测，优化实验条件下，在 0.2～200.0μg /L线性范围内，所得4种黄曲霉毒素的回归方程均具有良好的线性关系，相关系数为0.9987～0.9998, 检出限为0.043、0.031、0.028、0.018 μg/L，定量下限为0.142、0.103、0.0902、0/073 μg/L；加标回收率分别为84.6%～94.1%、80.3%～92.5%、82.7%～89.3%和81.8%～90.6%，精密度(RSD)为5.8～9.2%，可满足痕量分析的要求。

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