HBV共价闭合环状DNA Real-time PCR检测方法比较

曹经琳 窦剑 周文亭 任贵军

050051 石家庄，河北医科大学第三医院肝胆外科(曹经琳、窦剑、任贵军)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(周文亭)

·技术方法·

HBV共价闭合环状DNA Real-time PCR检测方法比较

曹经琳 窦剑 周文亭 任贵军

050051 石家庄，河北医科大学第三医院肝胆外科(曹经琳、窦剑、任贵军)；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(周文亭)

目的 比较HBV共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA, cccDNA) Real-time PCR检测方法。方法 选择文献中常用的普通Taq-Man探针及Taq-Man MGB探针两种检测方法，合成引物及探针，制备质粒标准品，提取乙肝患者血清及肝组织标本HBV DNA，分别用质粒安全ATP依赖的DNA酶(Plasmid-safe ATP-dependent DNase, PSAD)酶切，进行敏感性、特异性及重复性检测验证。结果 两种检测方法扩增质粒标准品均有良好线性关系(R20.989和0.976)，重复性良好(CV<4%)；检测PSAD酶切前后质粒、血清及肝组织HBV cccDNA均有良好特异性；检测相同浓度样品时普通Taq-Man探针Ct值较Taq-Man MGB探针略低。结论 两种方法均可用于HBV cccDNA检测，本实验所用的普通Taq-Man探针较Taq-Man MGB探针敏感性略高；MGB探针本底更低。实际工作中可根据需求选择适宜的探针。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，成熟病毒基因组由部分双链松弛环状DNA(Relaxed circular DNA，rcDNA)构成，在病毒感染细胞后rcDNA进入宿主细胞核形成共价闭合环状DNA(Cdovalently closed circular DNA，cccDNA)，与组蛋白结合形成游离的微小染色体存在于宿主细胞核中，作为HBV基因组转录复制的模板[1-2]。由于现有抗病毒药物不能有效清除HBV cccDNA，HBV持续感染与cccDNA的长期存在密切相关。因此选择适宜方法检测肝细胞中HBV cccDNA，有利于了解其在肝组织中的含量及分布特性，以及乙肝治疗现状及预后判断[3，4]。

目前对于HBV cccDNA检测有多种方法[3-6]并没有统一标准，Real-time PCR方法主要根据HBV rcDNA及cccDNA结构差异，设计跨rcDNA缺口的引物及探针，并用质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切，去除非特异反应，选择性扩增HBV cccDNA。本研究选择国内文献常用的两种Real-time PCR方法进行了比较[5，6]。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及标本 质粒提取试剂盒、肝组织DNA提取试剂盒购自美国Omega公司；血清HBV DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit购自德国Qiagen公司；克隆用pMD 20质粒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)荧光定量PCR试剂盒、样品RNA/DNA保存试剂(Sample Protector for RNA/DNA)购自日本TaKaRa公司；质粒安全ATP依赖DNA酶 (plasmid-safe ATP-dependent DNase) PSAD酶购自美国Epicentre 公司。

乙肝患者血清及肝癌组织标本来源于河北医科大学附属第三医院临床标本，放-70℃冰箱保存，肝组织标本运输按样品RNA/DNA保存试剂说明书进行。

1.2 方法

1.2.1 实验用引物及探针：跨HBV rcDNA缺口引物及探针分别引自参考文献[5，6]，见表1。

表1 引物及探针序列

1.2.2 质粒标准品的建立： 根据参考文献[5,6]，选取一份HBV DNA(HBV total DNA，HBV tDNA)滴度较高的血清标本(HBV tDNA>106拷贝/ml)，提取HBV DNA，应用引物BCF1和BCR1进行常规PCR扩增367 bp目的条带，纯化后连接到载体pMD-20，转化大肠埃希菌DH5ɑ、克隆、纯化扩增，提取质粒DNA，取部分质粒用PSAD酶切消化，用紫外分光光度计定量，并按公式：拷贝数/μl=6.02×1023×浓度(ng/μl)×10-9/(目的片段碱基数bp×660) 计算出质粒的拷贝数。

1.2.3 血清HBV DNA及肝组织DNA提取：血清HBV DNA提取采用德国Qiagen 公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit，取200 μl血清进行DNA提取，具体操作参照试剂盒说明书，DNA样品-20℃保存。肝癌组织中HBV DNA提取用Omega公司Tissue DNA kit，取30-60 mg肝组织提取DNA，具体操作参照试剂盒说明书，样品最后溶于160 μl 洗脱液中，DNA经紫外分光光度计定量，-20℃保存。

1.2.4 PSAD酶切消化：按PSAD酶说明书进行，25 μl 反应体系：1 μl 25 mmol/L ATP, 2.5 μl 10x反应缓冲液，1 μl PSAD (10U)，取质粒、血清HBV DNA、肝组织DNA 0.5-1 μl, 补水到25 μl：37℃ 消化1-2 h，70℃灭活10 min，-20℃保存。PSAD在适宜条件下，对线性双链DNA、线性单链DNA及环状单链DNA降解活性强，但不能降解共价闭合环状双链DNA或超螺旋DNA，可增加HBV cccDNA检测的特异性。

1.2.5 Real-time PCR检测: 方法1.参考文献[5]，每反应体系：10 μmm/L BCF1 或BCR1引物各0.4 μl, 10 μmm/L BCT1探针 0.8 μl，TaKaRa 2x Premix Ex TaqTM反应缓冲液10 μl, 模板2 μl，加水定容至20 μl。在ABI7500 real time PCR 仪上进行扩增，反应条件为95℃ 预变性30 s；95℃ 10 s, 55℃31s，72℃ 31 s，共45个循环。方法2.参考文献[6]：每反应体系10 μmm/L TCF2 或TCR2 引物各1 μl, 10 μmm/L TCT2 探针 2 μl，TaKaRa 2x Premix Ex TaqTM反应缓冲液10 μl,模板2 μl，加水定容至20 μl，反应条件为95℃ 预变性30 s；95℃ 15 s, 60℃40 s，共45个循环。

1.3 统计学方法 用ABI7500 software V2.3 软件及SAS9.2 软件进行数据录入与分析。计量资料以平均数±标准差表示，计算变异系数CV，Ct值配对t检以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准品的建立 PCR扩增目的片段，连接到质粒载体制备克隆质粒，提取纯化后，用PSAD酶切消化，测得质粒含量为147 ng/μl, 按公式计算为 1.78x1010拷贝/μl。用制备的质粒标准品进行荧光定量 PCR检测，结果表明两种方法均具有良好的线性关系，方法1与方法2的相关系数R2分别为0.989 和0.976。

2.2 两种检测方法的灵敏度比较 将上述标准品从1.78×106拷贝/μl 10倍稀释到1.78×101拷贝/μl，分别用两种方法进行Real-time PCR检测，结果见表2，方法1的Ct值略低于方法2，灵敏度略高于方法2。二种检测方法的Ct值经过配对t检验，t=-6.64，P=0.0012<0.05, 其Ct值差异有统计学意义。

表2 两种Real-time PCR方法检测不同浓度质粒样品结果

注：两种检测方法Ct值比较P<0.05

Note:Ctvalue comparison of the two detection methods,P<0.05

2.3 两种检测方法的特异性比较 上述两种方法分别用于检测PSAD酶切前后的质粒、肝组织及血清标本中HBV cccDNA，其Ct均值见图1，两种方法均能区分PSAD酶切前后HBV cccDNA，具有良好特异性。

用PSAD酶切后去除了线状及开环的HBV rcDNA等非特异反应，检测的只是共价闭合环状HBVcccDNA，核酸含量较未用PSAD酶切前有所降低，Ct值相应升高(Ct值越高表示核酸含量越少)。图1中质粒受PSAD酶切影响较小，Ct值增高不明显；肝组织中HBV cccDNA及HBV rcDNA等都存在，Ct值有一定变化；血清中主要为HBV rcDNA，PSAD酶切后去除了rcDNA等非特异反应，Ct值增高明显 (其中方法1Ct值由PSAD酶切前27.31±0.22升高到酶切后35.66±0.48；方法2由28.25±0.34升高到37.0±0.45)，分别处于两种检测方法的临界值或阴性值。

图1 质粒、肝组织及血清标本PSAD酶切前后分别用两种方法检测的Ct均值. a，c,e:用PSAD酶切； b,d,f:未用PSAD酶切Fig.1 Ct mean value of the samples (plasmid, liver tissue and serum) with or without PSAD digestion detected by two kinds of real time PCR methods. a,c,e:With PSAD digestion; b,d,f: Without PSAD digestion

2.4 重复性检测 质粒标准品从1.78 x 106-1.78x101分别用两种方法重复检测3次，结果见表2，两种方法的变异系数均在4% 以内，标准差均小于1，具有较好的重复性。

3 讨论

我国为HBV感染大国，2006年全国血清流行病学调查显示我国乙肝表面抗原阳性率为7.2%，HBV感染与肝硬化肝癌关系密切，对乙型肝炎的预防控制与治疗仍然十分重要[1]。

目前对肝组织细胞中HBV cccDNA检测并没有统一的标准方法，肝组织取样较困难且核酸提取有一定难度。Real time PCR法通常根据HBV rcDNA 与cccDNA结构差异，选择跨缺口引物及探针扩增HBV cccDNA，因高浓度rcDNA PCR产物可以跨过缺口产生假阳性，需用PSAD酶消化线性双链或单链DNA以及环状单链DNA，去除扩增中的非特异反应，常用的DNA酶包括PSAD酶，S1酶、绿豆核酸酶等，酶切时应掌握好底物DNA浓度及相关酶用量，使酶切消化完全彻底[4-7]。

本研究用两种探针对PSAD酶消化前后的质粒、血清及肝组织HBV cccDNA检测结果表明，质粒主要为闭合环状DNA，Ct值受PSAD酶切影响不大；肝组织中闭合环状cccDNA及部分双链环状rcDNA等形式都存在，PSAD酶切后Ct值有一定变化；血清中主要为rcDNA，经PSAD酶切去除非特异反应后，其HBV cccDNA明显降低，Ct值增高明显，分别处于两种检测方法的临界值或阴性值，其比肝组织中HBV cccDNA拷贝数降低要多。据文献报道[8]HBV cccDNA 主要存在于肝细胞核中，血清中的HBV cccDNA 一般认为是肝细胞坏死后其核中的HBV cccDNA释放到血清中所致，在血清中的浓度与肝细胞损害程度有关。今后应进一步检测更多标本以得到更多分析结果。

方法1[5]为常规Taq-Man探针，文献中检测下限为3.44×100拷贝/μl，需3步 Real time PCR反应耗时略长；方法2[6]是Taq-Man MGB探针，文献中检测灵敏度为4×102拷贝/ml，需2步 Real time PCR反应，MGB 标记费用略高；二者均能很好区分PSAD酶切前后HBV cccDNA，但研究所用引物及探针序列、标记荧光物质、选用质粒标准品及浓度换算、实验条件等均不同，未进行过平行比较。本研究用上述两种方法最佳条件对相同标本进行检测，进一步印证了相关文献报道[9]，表明两种检测方法各有优缺点，方法1敏感性略高，方法2本底更低。检测结果可能与两种方法所用引物及探针在HBV基因组中的位置、标记荧光物质等不同有关，更多影响因素有待更多实验结果进行验证。

据文献报导MGB探针在探针引物的3′ 端含有自身不发光的MGB(小型凹槽结合物)，结合DNA序列更稳固，提高了反应的Tm值，使得 Real time PCR 反应特异性更高[6]；同时因为探针较短(对于AT含量高的探针序列十分有利)，淬灭效果好，本底较低；但与常规 TaqMan 探针相比，MGB探针对模版要求更严格，二者出现一个碱基错配即不能杂交，灵敏度略低；常规 TaqMan 探针所需序列较 MGB探针长，可发光的荧光报告基团和淬灭基团距离较远，本底较高；但对于简并序列具有一定优势，敏感性也略高[9-11]。随着HBV cccDNA 检测技术的不断完善和选择更加敏感特异的引物及探针序列，希望会有更加敏感特异以及标准统一的HBV cccDNA 检测方法问世，以利于疾病的进一步诊断与治疗。

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Comparison of two Taq-man Real-time PCR methods for detection of HBV cccDNA

CaoJinglin,DouJian,ZhouWenting,RenGuijun.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheThirdHospital,HeBeiMedicalUniversity,Shijiazhuang, 050051,China(CaoJL、DouJ、RenGJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(ZhouWT).Correspondingauthor:CaoJinglin,Email:cjlcpx@sina.com

Objective To compare two Taq-man Real-time PCR methods for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA (HBV cccDNA) in serum or liver tissue. Methods Two sets of primers and probes (common Taq-Man probe and MGB Taq-Man probe) were synthesized according to the reference papers, and the sensitivity and specificity of the two methods were compared using prepared plasmid as standard curve, and HBV DNA samples were exlracted from serum and liver tissue samples of hepatitis B patients. The samples were tested with both methods separately before or after the digestion with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase (PSAD). Results Both of these two kinds of detection methods had a good linear relationship with the prepared plasmid as standard curve (R20.989 or 0.976 respectively, CV were within 4% ), and obtained good specificity when the HBV DNA samples were tested before or after digestion with PSAD. The common Taq-Man probe had lowerCtvalue than MGB probe when the samples in the same concentration. Conclusions Both methods can be used for HBV cccDNA detection. The common Taq-Man probe has slightly higher sensitivity than MGB probe, while the MGB probe has lower background than the common Taq-Man probe in our test. One can select the appropriate probe according to the need.

Hepatitis B Virus; Covalently closed circular DNA; Real-time PCR

曹经琳，Email：cjlcpx@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.015

肝炎病毒,乙型； 共价闭合环状DNA(cccDNA)；Real-time PCR

2016-11-21)