金铁锁糖基转移酶PtT1的克隆与生物信息学分析

李媛++李国栋++张爱丽++钱子刚

【摘要】目的：克隆金铁锁糖基转移酶（PtT1）全长基因，并进行生物信息学分析。方法：根据转录组数据，克隆金铁锁PtT1全长cDNA，命名为PtT1，并通过生物信息学软件对该基因进行蛋白结构预测和构建进化树等分析。结果：克隆得到PtT1基因，其cDNA全长1529bp，ORF长1377bp，编码458个氨基酸，相对分子质量为5125KDa，等电点580，定位于线粒体，与同科植物香石竹糖基转移酶基因DcT227具有很高的同源性。结论：成功克隆、分析了金铁锁PtT1基因，为金铁锁该基因的后续功能鉴定提供了基础。

【关键词】金铁锁；糖基转移酶；生物信息学

【中图分类号】R9141【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）04-0023-04

Cloning of PtT1 genes of Psammosilene tunicoides and BioinformaticsLI YuanLI GuodongZHANG Aili*QIAN Zigang*

Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants， Yunnan University

of Traditional， Chinese Medicine， Kunming 650500， ChinaAbstract：Subject To clone the glycosyltransferase gene（PtT1） in Psammosilene tunicoides， and to analyze the bioinformation of PtT1. Methods cDNA was reversely transcriped according to the Transcriptome Sequencing. The protein characteristics was analyzed and the phylogenetic tree of PtT1 was constructed using the bioinformatics. ResultsThe 1529bp sequence in P. tunicoides was obtained， which has a 1377bp ORF， encoding 458 amino acids. The protein molecular weight was5125KD， with the isoelectric point of 580. The protein was located at mitochondria. The PtT1 in P.tunicoides was most similar with Dianthus caryophyllus DcT227 by NCBI blast. Conclusions The PtT1 in P. tunicoides was successfully cloned and analyzed， which provides the foundation for this gene function characterization.

Keywords： Psammosilene tunicoides； Glycosyltransferase； Bioinformation

植物中化合物的糖基化是一种很普遍的生理现象，是植物细胞维持代谢平衡的主要机制之一[1]。糖基转移酶则是负责催化分子糖基化修饰反应的酶，其可将活性糖基从尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖（UDP-glucose）转移至次级代谢物及植物内外源毒性物质等一系列植物小分子化合物受体中[2]。糖基化经常是次生代谢产物主要的后修饰方式，往往修饰合成途径中的最终一步或几步。植物三萜皂苷类次生代谢产物，往往都具有较高的药理活性价值。其合成途径可前体形成，骨架构建及后修饰等三个过程[3]。次生代谢产物结构的基本骨架形成之后，经过细胞色素P450 酶和糖基转移酶等一系列关键酶基因的后修饰，最终形成众多种类繁多的三萜皂苷[4]。

金铁锁来源于石竹科金铁锁属植物金铁锁Psammosilene tunicoides W C Wu et C Y Wu的干燥根[5]。主要分布在云南、贵州、西藏等省，为云南的道地药材[6]，是云南白药等中成药的重要主要组成药之一。其活性成分为齐墩果烷型的三萜总皂苷[7-8]，具有显著镇痛、抗炎等的药理活性[9-10]。目前，参与金铁锁三萜皂苷合成途径前体形成，骨架构建等过程的关键酶基因都已有报道[11-12]，而后修饰环节中的糖基转移酶基因还未见报道。

鉴于此，本研究根据前期转录组数据，通过设计特异性引物克隆了一条金铁锁PtT1家族基因，命名为PtT1，并采用生物信息学软件对其蛋白质理化性质、結构特征、功能及系统演化关系等进行了预测分析。结果将为金铁锁PtT1基因的功能鉴定研究奠定基础，揭示金铁锁三萜皂苷的分子形成机制。

1仪器与材料

11植物材料金铁锁采集于云南省丽江市，经云南中医学院钱子刚教授鉴定为石竹科金铁锁属植物金铁锁Psammosilene tunicoides WCWu et C Y Wu。

12仪器高速冷冻离心机（eppendorf）；稳压稳流电泳仪（BIO-RAD公司）；DYC-33A微型电泳槽（BIO-RAD公司）；凝胶成像系统（BIO-RAD公司）；PCR反应扩增仪（BIO-RAD公司）；移液枪（范围100～1000μL，20～200μL，05～10μL）（eppendorf）。

13试剂EastepTM总RNA提取试剂盒（普洛麦格生产批号：7020001018）； PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa生产批号：AK3201）；TransStart KD Plus DNA Polymerase（Trans生产批号：K10511）；薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（GENEray生产批号：1601G20）；pEASY-T1 cloning kit（Trans生产批号：I40914）； DL2000 DNA Marker（TaKaRa生产批号：A2101A）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2方法

21引物设计根据金铁锁转录组中糖基转移酶基因序列，设计1对特异性引物PtT1F： AAAAATGAAACACCAAGAAAAGCAG，PtT1R： GATTGAAGAAACCAAAGAAGGGGGC。

22PtT1基因的克隆按照EastepTM总RNA提取试剂盒（普洛麦格）说明书提取金铁锁根中的总RNA；并根据PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）说明书合成cDNA。以cDNA为模板使用TransStart KD Plus DNA Polymerase（AP301）通过PCR扩增目的片段。表1PCR反应体系

ComponentsVolumeTemplate1 μLForward Primer（10 μM）1 μLReverse Primer（10 μM）1 μL5×TransStart KD Plus Buffer10 μL25 mM dNTPs4 μLTransStart KD Plus DNA Polymerase1 μLddH2Oto 50 μLPCR反应条件：94℃、5min；94℃、30s；45℃、30s，68℃、2 min30sec，35个循环；68℃延伸10min。PCR产物经10%琼脂糖凝胶电泳检测后，选取较亮的目的条带进行回收纯化，并将回收产物与1μL pEASY-T1 cloning kit（Trans）配成连接体系，热激转化到大肠杆菌感受态细胞后，涂布于含Amp+ 抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑选白色单克隆进行菌液PCR鉴定，选取阳性单克隆过夜摇菌保种后测序。

23金铁锁糖基转移酶基因的生物信息学分析在NCBI（http：//wwwncbinlmnihgov）网站上通过BLAST程序进行序列比对，应用 BioEdit翻译为氨基酸序列，使用ORF Finder（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）确定开放阅读框。并用ProtParam（http：//webexpasyorg/protparam/）预测蛋白质相对分子质量等；使用ProtScale（http：//webexpasyorg/protscale/）软件进行疏水性分析；TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）工具预测PtT1蛋白的跨膜螺旋区；Signal 30（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP-30/）預测蛋白质信号肽；利用在线工具TargetP 11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）预测PtT1的亚细胞定位情况。使用PORTER对二级结构预测SWISS-MODEL（http：//swissmodel expasyorg/interactive/k5MUhF/models/）服务器对三级结构预测；然后使用MEGA 50软件内置的NJ法构建系统进化树。

3结果与分析

31金铁锁PtT1基因的克隆以金铁锁根cDNA为模板进行PCR反应，扩增得到2000bp左右的片段。使用pEASY-T1载体通用引物对单克隆进行菌液PCR检测为阳性克隆后送样测序，结果表明扩增序列与转录组序列基本一致。见图1。

32PtT1基因的生物信息学分析PtT1糖基转移酶cDNA全长1529bp，ORF长1377bp，编码458个氨基酸。通过Blastn比对分析可知与石竹科香石竹同源性最高，为81%。采用ProtParam工具预测PtT1编码的氨基酸序列的蛋白质理化性质，从分析结果中可知PtT1的分子质量为5125KDa，理论等电点为580；在组成糖基转移酶的20种氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占的比例最高，达到114%；PtT1的不稳定指数为3719，为稳定蛋白；脂肪指数为9044。采用ProtScale分析PtT1氨基酸序列的疏水性/亲水性，结果显示415左右位置有一个典型的亲水性区域，见图2。

利用TMHMM 20对PtT1蛋白进行跨膜结构预测。推测其不存在跨膜区域，该糖基转移酶编码的蛋白不属于跨膜蛋白。见图3

使用SignalP 30对PtT1蛋白质的信号肽进行预测，由神经网络模型分析可判断该蛋白不存在信号肽。隐马尔夫模型进一步证实了金铁锁PtT1编码的蛋白是非分泌蛋白质，没有信号肽存在。将PtT1编码的蛋白质序列输入在线细胞定位分析工具TargetP 11服务器，分析表明目的蛋白的分泌途径为线粒体型，即定位在线粒体上。

对糖基转移酶PtT1的结构域进行预测，在190位到442位之间存在高度保守的结构功能域—UDPGT，即UDPGT家族成员共有的典型结构域。见图4。

利用PORTER对金铁锁PtT1进行二级结构分析，该蛋白二级结构中α-螺旋（H）占4432%，β-折叠（E）占1245%，无规则卷曲（C）占4323%，该蛋白质的二级结构属于混合型。利用Swiss-Model Workspace对糖基转移酶的蛋白质三维立体结构进行预测。见图5。

将金铁锁PtT1与GenBank数据库中17种植物的糖基转移酶蛋白进行Clustal W比对分析后，利用MEGA 51中的Neighbor-Joining 方法，构建系统进化树。结果表明金铁锁与同科植物香石竹聚为一类，亲缘关系最近；其次与北柴胡、小麦、拟南芥等植物的亲缘关系也比较接近，与蓖麻等植物中的PtT1亲缘关系较远。见图6。

4 讨论

糖基转移酶催基因催化三萜皂苷骨架糖基化的反应，其通过催化生物物体内已活化的糖，连接到不同的受体分子上，对一系列化合物进行激活、抑制或者调节溶解度，从而参与植物体多种调控和代谢途径。目前已发现的催化植物中天然产物糖基化的酶均属于糖基转移酶家族Ⅰ，其作用是将活性糖基从核苷糖（尿嘧啶核苷二磷酸糖）转移到包括次生代谢物在内的多种植物小分子化合物受体上[13]。

目前，仅有少数几个参与三萜皂苷生物合成的糖基转移酶被报道[14-19]。本研究立足于金铁锁转录组测序数据，从金铁锁根中克隆得到一条糖基转移酶基因PtT1，其cDNA全长1529bp，ORF长1377bp，编码458个氨基酸。Blast比对分析可知与同科植物香石竹有较高的同源性，保守结构域分析显示其具有UDPGT家族成员共有的典型结构域，说明所得糖基转移酶蛋白具有较高的结构保守性。通过构建进化树，发现该基因与香石竹、北柴胡、拟南芥等植物的亲缘关系比较接近。为进一步研究金铁锁糖基转移酶在大肠杆菌异源表达，三萜皂苷合成代谢途径及其关键酶表达模式等研究奠定一定的基础。参考文献

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（收稿日期：2016-12-05编辑：梁志庆）