口蹄疫病毒3C蛋白酶结构与功能及应用研究进展

姚怀兵，赵 毅，刘梦丽，朱 妍，刘 宏，任 方，黄 炯

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.天康生物股份有限公司,新疆乌鲁木齐 830000；3.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000)

口蹄疫病毒3C蛋白酶结构与功能及应用研究进展

姚怀兵1，3，赵 毅2，刘梦丽1，朱 妍1，刘 宏2，任 方2，黄 炯3*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.天康生物股份有限公司,新疆乌鲁木齐 830000；3.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000)

口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶是FMDV基因组编码中具有酶学活性的病毒产物之一，在FMDV编码蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内大量扩增中发挥着重要作用。3C蛋白酶能剪切多聚蛋白，降解特定的蛋白质，是宿主细胞中重要的毒力因子。3C蛋白酶能调控蛋白的转录和翻译，使宿主细胞内的干扰素等多种抗病毒基因低水平表达，使FMDV逃避宿主的天然免疫。论文主要综述了FMDV 3C蛋白酶的结构、生物学功能，并介绍了其在研制新型疫苗中的应用，以期为今后FMDV 3C蛋白酶的研究、新型疫苗的研发提供参考。

口蹄疫病毒；3C蛋白酶；结构；功能；应用

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员，其引起的口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是一种急性、烈性、高度接触性的传染病，对猪、牛、羊等偶蹄动物危害极大。FMDV基因组为单股正链RNA，是转录中的信使RNA(mRNA)，也是负链合成的模板。该病毒基因组约有8 500 个核苷酸(nts)，具有一个大的开放阅读框(ORF)，在感染的宿主细胞内翻译为一条多肽链，经自身编码的L前导蛋白酶、2A蛋白酶、3C蛋白酶裂解产生多功能蛋白，这些蛋白在FMDV的复制及免疫逃逸过程中发挥作用[1]。FMDV裂解过程中产生11个蛋白酶裂解位点，有9个位点是3C蛋白酶裂解位点[2-3]。3C基因全长639 bp，编码213个氨基酸，3C蛋白酶可专一性裂解P1结构蛋白成为3种衣壳蛋白VP0、VP3和VP1，产生主要的病毒抗原，它们共同诱导动物机体产生的体液免疫和细胞免疫[4]。

3C基因可参与构建腺病毒载体全衣壳重组疫苗和核酸疫苗[5-7]，免疫动物可以产生抗FMDV中和抗体，具有一定的攻毒保护力[8-9]。因此，在口蹄疫新型疫苗研发中具有重要的意义。3C蛋白酶在FMDV的多聚蛋白成熟的过程中具有举足轻重的作用，抑制3C蛋白酶的催化功能，可有效抑制对病毒前体蛋白的切割，阻断FMDV的复制[10]，是当前抗FMDV研究的一个潜在的药物靶点。3C蛋白酶在FMDV侵染宿主细胞的不同阶段中，发挥着不同的生物学作用。为此，本文通过对3C蛋白酶的结构、多重生物学功能及在研制新型疫苗中的作用前景进行综述，旨在为研制抗FMDV感染的新型疫苗提供基础信息。

1 3C蛋白酶结构

对晶体结构的测定是研究FMDV 3C蛋白酶的关键一步。Birthly J R等[11]通过X射线晶体衍射的技术分析了3C蛋白酶的空间结构，发现FMDV 3C蛋白酶的蛋白质折叠原则与其他已知的小RNA病毒3C蛋白酶所遵循原则一样，类似于原型的丝氨酸糜蛋白酶。Yang J等[12]运用结构基因组学研究方法，基因克隆、蛋白质纯化、晶体的筛选和晶体衍射数据的收集，成功构建出SAT2/GHA/8/91毒株晶体结构，收集到0.32 nm的分辨率衍射数据，在分子水平上深入了解3C蛋白酶的结构和功能。

FMDV 3C蛋白酶是集丝氨酸(Ser)和半胱氨酸(Cys)特性为一体的特殊蛋白酶类，以半胱氨酸(Cys)-组氨酸(His)-天冬氨酸(Asp)为活性中心，是一种具有高度保守特性的三维结构。氨基酸链首先形成两个β折叠片，进而折叠成两个类似于β折叠桶的结构域(domainⅠ和domainⅡ)，在这两个β折叠桶的结构域中有由组氨酸(His)-半胱氨酸(Cys)-谷氨酸(Glu)所形成的催化三联体，在结构域结合的凹槽中[13-14]来完成对底物的催化结合。两个β折叠桶结构域之间夹角约90°，在蛋白表面的两个β折叠桶结构域之间有一个肽链结合沟是3C蛋白酶的酶切活性位点。在FMDV 3C蛋白酶表面RNA结合面有一个保守的片层结构，位于高度保守95KFRD 199序列结构的中心，与酶的活性位点相对。已经研究表明，通过对FMDV 3C基因序列比对分析，3C基因是FMDV基因组其中最保守的片段，在3C蛋白酶结构中，β-片段虽然也比较保守，但在氨基酸138～150位具有一定程度的替换性，它能与缩氨酸结合活性位点直接接触，对底物的专一性具有重要的意义[15]。

随着X-射线衍射技术在获取3C蛋白酶空间结构中的应用，已有研究发现，3C蛋白酶空间结构较其他氨基酸序列的保守性更强，FMDV在进化过程中，3C蛋白酶氨基酸残基发生了替换，但对其α-螺旋和β-折叠等空间结构的稳定性没有影响。从氨基酸残基替换来看，3C蛋白酶与FMDV自身产生密切相关，其功能的高强度选择压力限制了其氨基酸残基的替换频率[16]。3C蛋白酶内部氨基酸残基的替换较少，替换主要发生在蛋白的表面，并且不会发生空间位移。因此，在维持3C蛋白酶结构的稳定性和功能的完整性上，FMDV内部氨基酸残基发挥着重要作用。

2 3C蛋白酶生物学功能

2.1 3C蛋白酶对多聚蛋白前体裂解的加工作用

FMDV 3C蛋白酶的主要功能是加工病毒多聚蛋白，在感染细胞中它也剪切宿主蛋白。当FMDV将产生的RNA运送到宿主细胞的细胞质内，意味病毒的感染开始。FMDV翻译出的前体多聚蛋白经一级裂解为结构蛋白P1和非结构蛋白P2、P3；经二级裂解为1A、1B、1C、1D、2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D；经三级裂解为3种～4种结构蛋白VP0或VP4、VP2、VP3、VP1(P1基因编码区)、8种～9种非结构蛋白Lab、Lb、2A、2B、2C(P2基因编码区)和3A、3B、3C、3D(P3基因编码区)，大多数蛋白的裂解由3C蛋白酶来完成，其中特别重要的是FMDV结构蛋白P1，经3C蛋白酶的裂解组装成为成熟的FMDV抗原。FMDV 3C蛋白酶具有广泛的肽键催化范围，周建华等[17]通过对7种血清型的FMDV以及不同种毒株间的氨基酸序列进行对比，发现在P1结构蛋白区催化裂解位点有谷氨酸(Glu)/甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)/甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)/苏氨酸(Thr)、谷氨酰胺(Gln)/亮氨酸(Leu)、谷氨酰胺(Gln)/甲硫氨酸(Met)，在P2和P3非结构蛋白区的催化裂解位点只有谷氨酰胺(Gln)/异亮氨酸(Ile)。

因此，FMDV 3C蛋白酶在FMDV P1区具有多个裂解位点，体现出了3C蛋白酶催化范围广的特点。在FMDV复制过程中，多聚蛋白水解产生功能蛋白，主要由3C蛋白酶完成，因此在FMDV的致病机理方面发挥重要作用。

2.2 3C蛋白酶调控宿主蛋白的翻译

3C蛋白酶是一种谷氨酰-甘氨酸特异性的蛋白酶，在细胞合成自身蛋白中，还可以参与切割eIF-4A和eIF-4G，eIF-4A和eIF-4G是一类重要的真核翻译起始因子，eIF-4A还对mRNA的解旋有重要的作用。FMDV 3C蛋白酶能通过切割eIF-4A，酶切位点为E143位，切割eIF-4G，酶切位点为E712位，从而抑制宿主蛋白的合成。宿主多聚胞嘧啶结合蛋白2(PcBP2)的主要功能之一是参与蛋白质合成，FMDV 3C蛋白酶还能通过PcBP2抑制蛋白的合成。杨春梅等[18]采用免疫共沉淀试验和激光共聚焦检测的方法，鉴定得出FMDV 3C蛋白酶能够切割PcBP2，并且具有剂量依赖性。而脊髓灰质炎病毒的3C蛋白酶却不具备此功能。因此有研究者推测，口蹄疫病毒在进化过程中形成了一种不同于其他小RNA病毒的转录机制[19]。因此，还需要更广泛和深入的对比研究来证明。

2.3 3C蛋白酶切割宿主组蛋白

FMDV感染宿主后，3C蛋白酶可参与切割宿主细胞核中的组蛋白3(histone 3，H3)，已有研究证明,3C蛋白酶在宿主组蛋白H3裂解中起主要作用。H3是组成核小体中央核心区的重要成分，它具有一个N端尾，空间构象可以发生变化，存在N端尾部上的可修饰位点对染色质功能很重要，它能通过DNA超螺旋圈之间延伸到核小体的外部，获得更多的DNA交联产物[20]。当H3的完整性被3C蛋白酶破坏后,染色质的复制或转化为染色体的过程会受到影响，残缺的H3已经无法满足DNA在转录起始之前所要求相对应的基因组在空间结构上变化的要求，从而阻碍了宿主细胞遗传物质的正常复制和转录[21]。因此，FMDV 3C蛋白酶在一定程度上抑制了宿主细胞的转录和翻译。

2.4 3C蛋白酶抑制干扰素信号通路

天然免疫不仅是机体抵抗病原体包括病毒、细菌等侵袭的第一道防线，而且是激活获得性免疫的基础。作为一种重要的抗病毒因子，干扰素在天然免疫研究领域具有十分重要的地位,为了更好地在宿主体内繁殖扩增，FMDV进化出了多种方式来阻断宿主产生Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)。已有研究发现，FMDV的L前导蛋白酶和3C蛋白酶都可抑制IFN-Ⅰ。IFN-Ⅰ是先天性免疫反应的主要成分，包括IFN-α和IFN-β，是抵抗病毒感染的第一道防线。FMDV 3C蛋白酶不仅能抑制IFN-α和IFN-β的产生，还能刺激IFN基因(ISGs)的表达，通过蛋白酶体和半胱氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性途径切割转录调控因子(NF-κB)，干扰Nemo的活性，Nemo是众多信号通路的泛素联结分子。张利杰[22]研究脑心肌炎病毒3C蛋白酶切割TANK对NF-κB启动子的活性影响，检测表明3C蛋白酶可以通过切割TANK调控NF-κB启动子的活性。Wang D等[23]发现， 3C蛋白酶将其C端锌指结构裂解下来，抑制了IFN的产生。因此，FMDV 3C蛋白酶能够通过切割宿主蛋白的Nemo的Q383 位、维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible gene Ⅰ,RIG Ⅰ)与天然免疫相关的分子，切断天然免疫信号通路，逃逸宿主的免疫抑制反应[24]。IFN-Ⅰ还能通过经典的Janus激酶-信号转导子与转录激活子(JAK-STAT)信号通路发挥抗病毒作用，是目前最新发现的多种细胞因子共用的信号传导途径。Du Y等[25]首次阐明FMDV 3C蛋白酶可以介导蛋白酶体和Caspase非依赖性途径,降解酪氨酸磷酸化的STATl核定位信号受体-核转运酶1(KPNA1)，从而切断信号转导与转录激活因子(STAT1/STAT2)的核转移，从而揭示了FMDV 3C蛋白酶已经进化到能够阻断宿主先天性免疫抗病毒的新机制。

综上所述，3C蛋白酶能够调控宿主细胞蛋白的转录和翻译，导致干扰素等多种抗病毒基因的低水平表达，从而逃避宿主细胞的抗病毒防御反应。

2.5 3C蛋白酶其裂解宿主底物和自身底物及特点

FMDV 3C裂解自身底物名称及氨基酸序列为：VP2-VP3，EFPSKE GIFPVA；VP3-VP1，VDARAE TTSAGE；VP1-2A，VAPVKQ TLNFDL；2B-2C，ERAEKQ LKARDI；2C-3A，HPIFKQ ISIPSQ；3A-3B1，EQPQAE GPYAGP；3B1-3B2，KLPQQE GPYAGP；3B2-3B3，APVVKE GPYEGP；3B3-3C，NLIVTE SGAPPT；3C-3D，PEPHHE GLIVDI。FMDV 3C裂解的宿主底物名称、功能及酶切位点为：真核起始翻译因子4AⅠ，ATP依赖的解旋、mRNA的帽结合，CIGGTNVRAE143VQKLQMEAPH；真核起始翻译因子4GⅠ，在翻译起始的早期协同和增强eIF4E的帽结合活性、eIF4A解旋酶活性、PABP的PolyA结合活性、eIF3的mRNA与核糖体40S结合活性，RRSQQGPRKE712PRKIIATVLM；组蛋白3，参核小体装配、DNA 结合，H3 的乙酰化可能通过促进将RNA多聚酶Ⅱ招募到启动子上而促进基因的转录TGGKAPRKQL120ATKAARKSAP；核因子kappa-B 重要调节子，Ubl联结，参与JNK、MyD88、TRIF依赖的TLR、NF-kappaB、MAPK信号通路，LSSPLALPSQ383RRSPPEEPPD。刘艳等[26]对小RNA病毒科自身蛋白酶进行了研究，分析了蛋白酶裂解位点，发现FMDV 3C蛋白酶切割的位点具有特异性：FMDV的底物特异裂解位点位于Glu-Val/Pro、Gln-Arg、Leu-Ala之间，而FMDV的自身特异裂解位点则集中于E-G/S/T或者Q-L/I/T。

总之，感染宿主早期必须通过各种策略来抵抗甚至破坏宿主细胞的天然免疫应答,为FMDV的入侵、复制和传播创造有利的环境,并争取足够的时间[27]。更加深入地研究与宿主天然免疫应答相互作用机制，将有助于进一步了解FMDV致病机理，为开发FMDV新型疫苗提供理论依据。

3 3C蛋白酶在口蹄疫疫苗研究中的应用

在过去，FMD弱毒疫苗和灭活疫苗在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但同时也存在疫苗株毒力返强、病毒逃逸或灭活不彻底等问题[28]。新型疫苗的研究不仅要能预防临床症状，而且要能预防感染，破坏病毒的感染周期。同时，也应该要具备安全有效、生产成本低、易保存及提供交叉免疫保护等优势[29]。因此，深入开展对FMDV的基因层次的研究，从中寻找有效方法是当前亟待解决的前沿问题。

多年的研究表明，3C蛋白酶在病毒自身成熟、病毒感染和抗病毒药物研制中的地位逐渐显现[30]。随着分子生物学技术的快速发展，国内外学者对FMDV 3C蛋白酶以及其在空衣壳疫苗方面的研究不断深入。李志勇[31]通过构建了Asia 1型FMDV Pl-2A和蛋白酶3C基因的重组病毒rBinNpV(P1-2A和3C)，利用家蚕杆状病毒生产出口蹄疫空衣壳苗；曹轶梅[32]通过构建Asia 1/JS/05株FMDV的衣壳蛋白P12A和蛋白酶3C基因的重组病毒，利用昆虫细胞组装产生FMD空衣壳病毒，结果证明，杆状病毒表达组装的空衣壳蛋白或中间体具有较好的免疫原性，这为深入研制FMD空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。Mohana等构建了含有O型FMDV P12A和3C基因的重组杆状病毒，结构蛋白P12A和蛋白酶3C在昆虫细胞Sf9中表达，并成功组装成FMDV病毒样颗粒(VLPs)。但是，病毒样颗粒疫苗多用昆虫细胞组装病毒样颗粒，系统表达组装的病毒样颗粒量少，成本比较高[33]。梁特等[34]采用Bac-to-bac杆状病毒表达系统，构建表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒，用昆虫细胞Sf9去培养重组杆状病毒，可以高效地表达出O型FMDV衣壳蛋白，为研制安全有效的O型FMD空衣壳疫苗奠定了基础。Zhou Z等[35]研究表明，FMDV的3C蛋白酶不仅能使微管蛋白组织丢失，破坏微管中心组织，还能诱导表达高尔基体及到质膜流动区域的蛋白质，此研究对FMDV 3C蛋白酶调节病毒蛋白分泌途径有了新的认识。马琪等[36]构建了含有O型FMDV蛋白酶3C基因真核表达质粒pcDNA3.1(-)-3C，并对其在哺乳细胞(BHK-21)中进行了表达，为以后进一步研究O型口蹄疫空衣壳的体外组装以及O型口蹄疫空衣壳疫苗的研制提供了试验基础。Ma W等[37]为了降低了3C蛋白酶的对宿主细胞的影响，构建了一个可以与其3C蛋白酶共表达衣壳前体rGPTV。通过对rGPTV的分析，确定FMDV结构蛋白能被水解加工组装成病毒样颗粒，且具有免疫原性。当外界的环境压力刺激真核细胞时，上游的激酶会磷酸化eIF2α因子，43 S复合物组装会受阻，起始蛋白的翻译暂缓，使翻译途径的mRNA聚集到胞浆内形成了一种高密度结构，称为SGs。马俊等[38]用FMDV 3C蛋白酶抑制G3BP1介导的应激颗粒形成，表明FMDV 3C蛋白酶的活性可参与切割G3BP1及抑制SGs形成，通过研究FMDV与SGs的关系，以及对其机制的探索，为进一步阐明FMDV的致病及免疫逃避机制奠定基础。口蹄疫病毒内部核糖体进入位点(IRES)介导的起始代表一种大多数细胞mRNA采用依赖帽(结构)的起始机制的选择。已有大量研究表明，空衣壳蛋白具有天然病毒粒子的免疫原性和抗原性，Srinivas V M V等[39]研究利用杆状病毒系统IRES介导FMDV 3C蛋白酶的表达，可以提高口蹄疫病毒空衣壳蛋白的产量。为大量生产体外合成病毒空衣壳蛋白粒子建立了有效的方法。

4 结语

虽然人们对于FMDV的基因组结构与功能、病毒与宿主的相互作用及致病机理等已经有了一定的了解，但是还有很多问题不清楚，特别是FMDV基因组不同结构区域如何共同影响病毒的毒力与持续性感染等方面还有待深入研究[40]。国内外学者针对FMDV的新型疫苗仍在不断地研究，但对于FMDV的空衣壳疫苗和病毒样颗粒的研究目前仍停留在衣壳蛋白的构建和表达鉴定等方面，商品化的FMDV空衣壳疫苗和病毒样颗粒疫苗还尚未见报道。

3C蛋白酶不但可作为标记疫苗的抑制剂在不同的毒株中起作用，而且在抗病毒疫苗设计方面也具有指导作用，其结构、作用机理的阐明为FMDV新型疫苗的设计打下基础。在未来的发展中，相信3C蛋白酶的研究将在FMDV攻克方面有重要的指导价值，FMDV空衣壳疫苗、病毒颗粒样疫苗的研究领域将更加广泛和深入。

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Advance in Structure,Function and Application of 3C Protease of Foot-and-mouth Disease Virus

YAO Huai-bing1,3，ZHAO Yi2，LIU Meng-li1，ZHU Yan1，LIU Hong2，REN Fang2，HUANG Jiong3

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.TeconBio-technologyCo，Urumqi，Xinjiang，830000，China；3.InstituteofVeterinaryMedicine，XinjiangAcademyofAnimalScience，Urumqi，Xinjiang，830000，China)

Foot-and-mouth disease virus(FMDV) 3C protease encoded in the genome is one of viral products with enzymatic activities,and plays important roles in FMDV protein maturation and progeny virus proliferation in the host cells.3C protease can be a major virulence factor of FMDV,which is a key factor for the degradation of specific proteins in the host cell and the protein degradation by the virus.It can regulate the transcription and translation of the host cell protein,resulting in a low level of expression of a variety of anti viral genes,including interferon,thus evading the host's innate immunity.This review summarized the research progress of the structure,biological function and their application prospect of FMDV 3C protease in order to provide references for the research of FMDV 3C protease and development of new vaccine in the future.

Foot-and-mouth disease virus(FMDV);3C protease;structure;function;application

2016-09-02

新疆维吾尔自治区科研机构创新发展专项资金项目(2016D04008)；新疆维吾尔自治区产学研联合培养研究生示范基地项目(xjaucxy-yjs-20152008)

姚怀兵(1990-)，男，新疆五家渠人，硕士研究生，主要从事口蹄疫病毒的研究。*通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)03-0102-05