4b型单核细胞增生李斯特菌内化素基因NTSN_0462的功能初探

赵 丹，姚 浩，蔡雪薛，孔苏伟，恽 茜，谈卫军，潘志明，殷月兰，焦新安

4b型单核细胞增生李斯特菌内化素基因NTSN_0462的功能初探

赵 丹，姚 浩，蔡雪薛，孔苏伟，恽 茜，谈卫军，潘志明，殷月兰，焦新安

目的 单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)对宿主的粘附、侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关。本研究以4b型菌株LmNTSN的內化素基因NTSN_0462为研究对象，初步探究其致病作用。方法 利用同源重组技术构建该基因缺失的突变株，研究0462基因对NTSN在生长、细胞侵袭和体内定植中的作用。人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2的侵袭率，以及BALB/c小鼠体内肝、脾脏中定植能力的差异。结果 缺失株的生长曲线结果显示，NTSN_0462基因对Lm在BHI培养基中的生长及代谢未造成明显影响。以人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2进行的体外试验表明，缺失株的侵袭能力低于野生株(P<0.001)。以BALB/c小鼠进行的体内试验显示，缺失株在肝脏中定殖的能力显著低于野生株(P<0.001)，在脾脏中无统计学差异。结论NTSN_0462基因在LmNTSN入侵肝脏和定植中发挥重要作用，是侵袭相关的重要毒力因子。

单核细胞增生李斯特菌；NTSN_0462；血清型4b；内化素

单核细胞增生性李斯特菌是一种兼性胞内寄生菌，其感染的宿主范围较广，可引发人和多种动物的李斯特菌病。作为食源性病原菌，Lm主要通过污染的食物进入肠道继而引发宿主的感染，感染后的临床症状主要表现为胃肠炎、脑膜炎、脑炎、流产等。新生儿、孕妇、老年人以及免疫功能缺陷者较容易感染Lm，对于人类致死率高达20%～30%[1-3]。20世纪90年代，Lm已被WHO世界卫生组织列为食品中的四大致病菌之一。

在导致宿主食源性感染过程中，Lm可以依赖其特有的表面蛋白侵入宿主非吞噬细胞，进而突破宿主肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障。内化素家族蛋白是一类含有亮氨酸重复区域(LRRs)序列的表面蛋白，在Lm入侵宿主非吞噬细胞过程中发挥重要的作用[5]。依据内化素蛋白的一级结构，可以将其分为3类：含有LPXTG结构的内化素，含有GW/WxL结构的内化素和分泌型内化素。其中含有LPXTG结构的内化素的C末端LPXTG结构可以被转肽酶A(StrA)识别，并以共价键的方式结合于细胞壁磷壁酸；而GW结构是以甘氨酸和色氨酸为起始的含80个氨基酸序列的重复结构，WxL区域与GW结构类似，均通过非共价键的方式与磷壁酸结合，将蛋白锚定于细菌细胞壁表面[5]。

内化素InlB蛋白由630个氨基酸序列组成，其一级结构包括信号肽序列、7个LRRs序列、IR序列、B重复序列和3个GW序列，是含有GW/WxL结构的典型内化素蛋白。Bielecki的研究表明，inlA和inlB基因均由Lm毒力岛Ⅱ(LIPI-Ⅱ)编码，LIPI-Ⅱ主要介导Lm对宿主非吞噬细胞的粘附侵袭作用，InlA蛋白与细胞表面受体E-钙粘蛋白(E-cad)的相互作用介导Lm对上皮细胞的侵袭作用[2,4]。InlB蛋白主要有3种受体：补体分子受体(gC1qR)、肝细胞生长因子受体(Met)和葡糖氨基聚糖类(GAGs)，其中Met为InlB蛋白的主要受体[5]。NTSN_0462基因是具有GW结构的內化素蛋白，为了研究该蛋白的功能，本研究以从暴发李斯特菌病的绵羊脑内分离株LmNTSN为亲本株，通过同源重组的方法构建了NTSN_0462的缺失突变株，并对其生物学特性进行了研究，为今后4b型Lm致病机理的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α、血清型4b的绵羊脑分离株LmNTSN、穿梭载体pKSV7均由本实验室保存，pGEM-T载体购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司。

1.1.2 实验动物和细胞 6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华公司。人结肠腺癌细胞系Caco-2由本实验室保存，人肝癌细胞系HepG2购自上海博古科技有限公司。

1.1.3 培养基 试剂BHI培养基(BactoTM Brain Heart Infusion)购自BD公司。

1.1.4 主要试剂和仪器 细菌基因组DNA抽提纯化试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，DNA纯化回收试剂盒、DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、限制性核酸内切酶(SalⅠ、KpnⅠ)、DL2000 DNA Marker、λ-14 DNA Marker、T4连接酶、氨苄青霉素(Amp)均购自大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司，氯霉素购自生工生物工程公司，PCR扩增仪、凝胶成像系统购自Bio-RAD公司，离心机、电转化仪、Biophotometer分光光度计购自德国Eppendorf公司，恒温CO2培养箱购自Thermo公司。

1.1.5 引物 从NTSN全基因组中获得NTSN_0462基因及其上下游序列，利用Primer Premier 5.0软件设计其上游片段引物P1和P2，引物之间跨度为500 bp；设计其下游片段引物P3和P4，引物之间的跨度为700 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 目的基因引物序列
Tab.1 Primers sequences of target genes

PrimersSequence(5'-3')SizeofPCRproduct(bp)DigestionsiteP1GCGTCGACATCAAAT-CATTGCGAATAAT-AGTG500SalⅠP2GAAATAGCTTTTCG-TAGGTTGATGATTAAT-AGATTTP3TCTGAATAAATCTAT-TAATCATCAACCTAC-GAAAAGCTATTTC700P4CACGGTACCATTTA-AACCACTCCTTCAKpnⅠPP1CTATTATTTTTAGTT-TATGG1577PP2TTCCTACGAATGCTT-GCTT

1.2LmNTSNΔ0462缺失突变株的构建

1.2.1 目的基因的制备 收集LmNTSN过夜培养物，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取NTSN基因组。以得到的基因组为模板，以P1、P2为引物合成NTSN_0462基因上游片段bu；以P3、P4为引物合成NTSN_0462基因下游片段bd。PCR扩增体系：10×PCR buffer 5 μL；dNTP 4 μL；DNA 模板2 μL；P1/P2 1 μL；P3/P4 1 μL；高保真酶0.5 μL；SW 36.5 μL。PCR扩增条件：Tm为55 ℃，30个循环。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收，以回收产物为模板，以P1、P4 为引物，经SOEing PCR 合成融合基因片段bu/bd。

融合片段bu/bd经DNA纯化回收试剂盒纯化后与pGEM-T载体相连，热击法转化至E.coliDH5α宿主菌中，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落培养，提取质粒进行PCR鉴定，PCR体系如前所述，验证正确后进行SalⅠ和KpnⅠ的双酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的克隆pGEM-T-bu/bd送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果通过NCBI中的BLAST进行比对分析，取比对正确的阳性克隆进行保存，并作为下一步构建的实验材料。

1.2.2 目的基因与pKSV7载体的连接 取测序正确的阳性克隆提取质粒，经SalⅠ、KpnⅠ双酶切，酶切产物经DNA纯化回收试剂盒回收，穿梭载体pKSV7经同样的方法处理。对回收后的载体片段和目的基因在T4连接酶作用下于16 ℃恒温器中过夜连接。次日，连接产物通过热击法转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态中。通过PCR和双酶切法鉴定重组质粒，将鉴定正确的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，并将测序正确的质粒命名为pKSV7-bu/bd。

1.2.3LmNTSNΔ0462的构建及鉴定 挑取测序正确的pKSV7-bu/bd质粒，采用电转化的方法(2 100 V)将重组质粒转化至LmNTSN感受态中，电转化涂布于氯霉素(Cm+)抗性(10 μg/mL)BHI平板，置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。挑取菌落进行PCR鉴定，鉴定正确的菌株即为阳性克隆。将获得的阳性克隆在温度(42 ℃)及氯霉素抗性(10 μg/mL)双重压力下传至14代，使目的片段与细菌基因组发生同源重组，将同源重组成功的细菌在30 ℃无抗性压力下脱去抗性载体，获得在氯霉素(10 μg/mL)抗性平板上无法生长而在无抗BHI平板上正常生长的细菌。以NTSN_0462基因上下游臂外围引物PP1、PP2为引物，对获得的菌株进行PCR鉴定，PCR扩增序列送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果经BLAST比对，将鉴定正确的细菌命名为LmNTSNΔ0462。

1.3 细菌生长曲线的测定 将Lm菌株NTSN、NTSNΔ0462分别接种到新鲜BHI培养基中过夜培养，次日取1 mL菌液，12 000 r/min 室温离心2 min。经PBS重悬，测定细菌的OD600值，将细菌分别转接到含有10 mL BHI 培养基的小锥形瓶中，每组细菌设立3个平行重复，并使其初始OD600值为0.05，放于37 ℃摇床培养，间隔1 h 测定1次各瓶的OD600值并做相应记录。

1.4 细胞侵袭实验 对生长状态良好的Caco-2或HepG2细胞进行计数，同时换用无抗DMEM培养基继续培养1 h。按细菌与细胞的数量比(MOI)=20加入新鲜培养的NTSN、NTSNΔ0462菌株继续培养1 h后，细胞用无菌PBS洗3次，加入含100 mg/mL硫酸庆大霉素的DMEM培养基继续培养2 h。PBS洗3次，加入1 mL 0.2% Triton X-100裂解细胞8 min，释放细菌，用无菌PBS稀释裂解液，涂布与BHI平板，置于37 ℃温箱培养20 h后菌落计数，每组设置3个重复。

1.5Lm对BALB/c小鼠的腹腔感染实验 挑单菌落接种于BHI液体培养中，于37 ℃、180 r/min过夜培养，次日将种子液按1∶50的比例重新接种于新鲜的BHI培养基中，于37 ℃、180 r/min振摇培养3 h，经无菌PBS洗涤2次后，调整细菌OD600值至0.8。将6周龄BALB/c雌性小鼠随机分为2，每组5只，腹腔注射免疫。每只小鼠的注射剂量为100 μL，1×104CFU细菌/只，同时将细菌适度稀释后涂布BHI平板，菌落计数。72 h后，分析小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量，并进行统计学分析。

2 结 果

2.1LmNTSNΔ0462缺失株的构建

2.1.1 目的基因的制备 通过PCR的方法扩增出NTSN_0462基因上下游片段bu、bd，片段大小分别为500 bp、700 bp。对这两个DNA片段进行SOEing PCR，扩增出一条为1 200 bp的特异性条带。纯化回收，与pGEM-T载体16 ℃过夜连接后转化至E.coliDH5α感受态中。通过双酶切方法验证，目的基因条带大小为1 200 bp，载体条带大小约为3 000 bp，结果正确。将酶切鉴定正确的克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，对测序结果进行比对分析，结果表明bu/bd融合片段与pGEM-T载体正确连接。

2.1.2 目的基因与pKSV7载体的连接 双酶切显示目的基因条带大小为1 200 bp，载体条带大小为6 900 bp，结果正确。将酶切鉴定正确的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，对测序结果进行比对分析，表明bu/bd融合片段与pKSV7载体正确连接。

2.1.3LmNTSNΔ0462的构建及鉴定 取测序正确的的重组质粒pKSV7-bu/bd电转化至NTSN感受态中。PCR鉴定转化产物。取PCR结果为阳性的克隆在温度和氯霉素抗性双重选择压力下传至14代，使目的片段与细菌基因组之间发生同源重组。将同源重组成功的细菌在30 ℃无抗性压力下脱去抗性载体，获得在氯霉素(10 μg/mL)的抗性平板上无法生长，在无抗BHI平板可正常生长的菌株。对获得的细菌进行PCR验证，结果如图1所示，在1 200 bp处有一条清晰的目的条带。再以外侧引物PP1、PP2 PCR鉴定获得的细菌，如图2所示，缺失株扩增的目的条带大小为1 577 bp，将PCR扩增产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，对测序结果进行比对分析，结果表明LmNTSN的inlB基因已成功缺失。

M: DL2000 DNA marker;1-2: PCR product of NTSN-pKSV7-bu/bd.图1 重组菌的PCR筛选Fig.1 Result of mutant strains identified by PCR

M: λ-14 DNA marker;1-2: PCR product of NTSN Δ0462;3: PCR product of NTSN图2 突变株的鉴定图Fig.2 Identification of mutant strains by PCR

2.2 细菌生长曲线的测定Lm的生长曲线如图3所示，NTSN和NTSNΔ0462的生长趋势基本一致：37 ℃培养环境中，6 h内细菌呈指数形式增长，6 h后，细菌增殖进入平稳期。这表明NTSN_0462基因的缺失未对细菌生长造成明显的影响。

图3 细菌生长曲线的测定Fig.3 The growth curve of Lm at 37 ℃

2.3 细胞侵袭实验 本研究通过相对侵袭率直观地显示出野生株与缺失株对Caco-2以及HepG2细胞侵袭的差别。结果如图4，图5所示，NTSNΔ0462对Caco-2和HepG2的侵袭率低于野生株(P<0.001)，表明NTSN_0462基因在Lm对Caco-2和HepG2细胞侵袭过程中发挥重要作用。

图4 Lm对Caco-2细胞系的侵袭Fig.4 Invasion of Lm into Caco-2 cell line

图5 Lm对HepG2细胞系的侵袭Fig.5 Invasion of Lm into HepG2 cell line

2.4Lm对BALB/c小鼠的腹腔感染实验 用NTSN和NTSNΔ0462分别腹腔感染BALB/c小鼠，感染剂量为0.1 LD50，即1×104CFU/只。感染72 h后分析野生株与缺失株在小鼠脾脏、肝脏中的细菌载量。结果如图6所示，NTSNΔ0462缺失株在肝脏中的分离率低于野生株(P<0.01)，在脾脏中则没有明显变化，结果表明NTSN_0462基因的缺失导致Lm对小鼠致病力明显下降。

图6 Lm腹腔感染小鼠后组织中的载菌量Fig.6 Bacterial counts in organ homogenates of mice at 72 h i.p. Infected with Lm

3 讨 论

单核细胞增生性李斯特菌为食源性兼性胞内寄生菌，通过污染的食物进入肠道，在其毒力因子作用下突破宿主的肠道屏障、胎盘屏障和血脑屏障进行扩散和传播，从而引发人和40多种动物的感染，具有较高的死亡率[1]。在Lm的致病作用中，内化素蛋白家族(Internalins)是介导该菌粘附与入侵宿主细胞的主要因子，在其致病力方面发挥着重要的作用。NTSN菌株中共有26个內化素家族蛋白，本研究以LmNTSN_0462基因为研究对象，对其致病作用进行了初步的探讨。

InlB是内化素家族中含有GW/WxL结构的典型内化素蛋白，目前对该蛋白的研究主要基于血清型1/2a的EGDe菌株开展的，NTSN与该模式菌株InlB蛋白的同源性虽然达到94%，但在该蛋白的多个LRR结构域、B重复区和GW重复区共存在28个氨基酸的明显差异，为此，本研究利用同源重组的方法成功构建了NTSNΔ0462缺失株，在对缺失株和野生株体内外感染特性进行研究的基础上，探究4b型菌株含有GW结构的內化素蛋白的功能。

在造成宿主食源性感染过程中，Lm可依赖其表面蛋白入侵宿主的巨噬细胞及多种非吞噬细胞，并在胞内存活和增殖[6-9]。内化素蛋白作为细菌表面蛋白，与Lm粘附侵袭非吞噬细胞的过程密切相关[10-13]。本研究中以人结肠腺癌细胞系Caco-2和人肝癌细胞系HepG2细胞系为研究材料，对NTSNΔ0462的粘附侵袭特性进行了研究。结果显示，与亲本株相比，NTSNΔ0462缺失突变株对Caco-2细胞系的侵袭率降低了78%，对HepG2细胞系的侵袭率则降低了98%。缺失突变株对两株细胞系的侵袭率均低于野生株，表明NTSN_0462编码蛋白在LmNTSN侵入上皮细胞和肝细胞时均发挥内化作用，但在入侵肝细胞时的内化作用更为明显。

内化素蛋白InlA、InlB的作用受体具有种属特异性，InlA蛋白不能识别小鼠的细胞表面受体E-钙粘蛋白(E-cad)，却可以作用于人、豚鼠和兔子的E-cad；而InlB蛋白与肝细胞生长因子受体(Met)的相互作用则正好与之相反[14-15]。本研究选用BALB/c小鼠作为研究模型，选择腹腔注射途径，对NTSNΔ0462缺失突变株和亲本株体内感染特性进行了测定，结果显示缺失突变株在小鼠肝脏中的细菌载量低于野生株，提示NTSN_0462基因在NTSN侵入肝脏进行定植中发挥重要作用，与体外侵袭试验的结果一致，表明该基因参与了NTSN的体内致病作用。

本研究成功构建了单核细胞增生李斯特菌NTSN_0462基因缺失突变株，并对缺失株的生长、代谢、对细胞的侵袭以及对小鼠的毒力进行了研究，表明该內化素基因在Lm侵袭Caco-2和HepG2细胞系及小鼠肝脏定植中发挥重要作用，是NTSN菌株的重要致病因子，也为揭示NTSN_0462编码蛋白在Lm感染过程中作用机制奠定了理论基础。

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Function of an internalin geneNTSN_0462 inListeriamonocytognesserotype 4b

ZHAO Dan, YAO Hao, CAI Xue-xue, KONG Su-wei, YUN-Xi, TAN Wei-jun, PAN Zhi-ming, YIN Yue-lan, JIAO Xin-an

(JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseaseandZoonoses,JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis,YangzhouUniversity,JointInternationalResearchLaboratoryofAgricultureAgri-ProductSafety,Yangzhou225009,China)

Internalins play a key role in the adhesion and invasion ofL.monocytogenesinto host cells. In this study, the function of internalin geneNTSN_0462 in serotype 4bLmNTSN was probed into. Firstly,NTSN_0462 was knocked out by homology recombination, then the pathogenic characterization of mutant strainLmNTSNΔ0462 was investigatedinvivoandinvitro. The growth curve showed that the deletion ofNTSN_0462 gene didn't affect growth and metabolism ofLmin BHI medium. The invasion of the mutant strain into human intestinal epithelial cell line Caco-2 and human hepatocyte cell line HepG2 significantly reduced comparing with the WT strains (P<0.001). Furthermore, the infection ability to BALB/c mouse was analyzedinvivo, compared with the WT strains, the colonization ofLmNTSNΔ0462 in liver decreased significantly (P<0.001), wheareas there was no significant difference in the spleen, indicating thatNTSN_0462 plays an important role in the invasion and multiplication in host livers, heretofore it is an invasion-related virulent factor ofL.monocytogenes.

Listeriamonocytogenes;NTSN_0462; serotype 4; internalin

Yin Yue-lan, Email: yylan@yzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.005

国家自然科学基金 (Nos. 31472193, 31101841)，江苏高校优势学科建设工程项目资助

扬州大学/江苏省人兽共患病重点实验室/江苏省动物重要疫病和人兽共患病防控协同创新中心/农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州 225009

R378

A

1002-2694(2017)02-0115-05

2016-09-26 编辑：刘岱伟

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31472193 & 31101841) and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions