南海圆鲣肌肉组织酶解产物抗疲劳活性的初步研究

章超桦， 苏 阳， 曹文红， 卢虹玉

(1.广东海洋大学 食品科技学院/广东省水产品加工与安全重点实验室， 广东 湛江 524088;2.南海生物资源开发与利用协同创新中心， 广东 广州 510275)

章超桦1，2， 苏 阳1， 曹文红1， 卢虹玉1

(1.广东海洋大学 食品科技学院/广东省水产品加工与安全重点实验室， 广东 湛江 524088;2.南海生物资源开发与利用协同创新中心， 广东 广州 510275)

圆鲣是我国南海高产低值的一类金枪鱼。对其肌肉组织的普通肉和暗色肉进行了酶解及氨基酸组成分析，并进行了抗疲劳活性动物实验评价。圆鲣的普通肉酶解产物冻干粉和暗色肉酶解产物冻干粉的氨基酸质量分数分别为57.06%和58.90%，其中支链氨基酸含量占总氨基酸的约18%。普通肉酶解产物冻干粉和暗色肉酶解产物冻干粉中分子质量5 000 Da以下肽的质量分数均达到70%以上，700 Da以下的肽占20%以上。与空白对照组相比，圆鲣的普通肉酶解产物冻干粉和暗色肉酶解产物冻干粉的各剂量组均具备显著延长小鼠负重游泳时间，增加小鼠肝糖原储备和降低运动后小鼠血清尿素氮含量的作用，表明2种酶解产物均有显著的抗疲劳活性，且二者无显著差异。研究结果表明，圆鲣的普通肉和暗色肉组织均可作为抗疲劳保健产品潜在的开发对象。

圆鲣； 普通肉； 暗色肉； 酶解； 抗疲劳活性

1 材料与方法

1.1 实验材料

木瓜蛋白酶(6.0×105U/g)、中性蛋白酶(3.0×105U/g)，广西南宁庞博生物工程有限公司；肝糖原试剂盒、血清尿素氮试剂盒，南京建成生物工程有限公司； SDS- PAGE超低分子质量标准蛋白质(20 100，14 400，7 823，5 856，3 312 Da)，马尿酰- 组氨酰- 亮氨酸(433 Da)，美国Sigma- Aldrich公司；硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、氢氧化钠、盐酸、甲醛、磷酸二氢钾、硼酸、石油醚等均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 一般成分分析

水分的测定参照GB/T 5009.3—2010，采用常压干燥法。

灰分的测定参照GB/T 5009.4—2010，采用高温灼烧法。

粗蛋白的测定参照GB/T 5009.3—2003，采用微量凯氏定氮法。

总糖含量的测定参照GB/T 9695.31—2008，采用苯酚硫酸法。

粗脂肪的测定参照GB/T 5009.6—2003，采用索氏提取法。

1.2.3 氨基酸组成的测定

将样品经6 mol/L HCl水解后，采用日立835- 50型高速氨基酸分析仪进行17种蛋白质构成氨基酸的分析；另取样品经5 mol/L NaOH水解，同机测定色氨酸含量。

1.2.4 酶解产物分子质量分布测定

色谱条件。色谱柱为Waters Protein- pak 60 (WAT085250)；流动相为浓度0.05 mol/L，pH值为 7.2的Tris- HCl缓冲液；柱温为25 ℃；洗脱速度为0.7 mL/min；进样体积为20 μL；检测波长为214 nm。

标准品为SDS- PAGE超低分子质量标准蛋白质(20 100，14 400，7 823，5 856，3 312 Da)和马尿酰- 组氨酰- 亮氨酸。以标准品保留时间(t)和分子质量(M)的对数lgM作图，得到分子质量回归方法为：lgM=-0.208t+6.094 5(R2=0.990 5)。

实验动物分组。实验动物为昆明种雄性小鼠，体重在18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供(动物许可证号：SCXK(粤)2013—0002)。160只雄性小鼠，适养3 d后剔除不合格个体并称重，随机将其分成8组。OMHP、DMHP和西洋参含片在灌胃前配制成水溶液，每天上午8:00～9:00灌胃1次，连续30 d后进行游泳实验。期间小鼠自由采食及饮水，保证饲养环境安静，垫料每隔2日换1次。每隔3日对小鼠进行称重，观察小鼠体重的变化。

负重游泳实验。每次灌胃前对小鼠进行称重，灌胃30 min后小鼠进行负重游泳实验。在小鼠鼠尾根部负荷5% 体重的铅坠，将其置于水深约40 cm，水温(25±1) ℃的游泳箱中游泳。在实验过程中需使小鼠的四肢保持运动，若小鼠漂浮不动，可在其附近搅动水流迫使其运动。用秒表记录小鼠从游泳开始至鼻孔完全没入水中并10 s不上浮的时间，即小鼠力竭时间。

血清尿素氮含量测定。每次灌胃前对小鼠进行称重，灌胃后休息30 min。将小鼠置于(30±1) ℃的游泳箱中不负重游泳90 min后，将眼睛周围擦干净，眼球取血，将采集的血置于4 ℃冰箱约1 h后，3 000 r/min，离心15 min，取血清按照试剂盒说明书测定小鼠运动后血清尿素氮含量。

肝糖原含量测定。小鼠每次灌胃后休息30 min，然后置于(30±1) ℃的游泳箱中不负重游泳90 min后，当即处死，解剖取小鼠新鲜肝脏，经生理盐水洗净血水后用滤纸吸干放入密封袋中保存，1 d内按肝糖原试剂盒说明对小鼠肝糖原进行检测。

1.3 实验数据处理

采用SPASS 软件对实验结果进行统计学处理，选择Duncan’s multiple range test 判断各组之间差异的显著性；平均值及标准偏差数据处理用Excel 2007 软件计算。

2 结果与分析

2.1 一般营养成分分析

由表1可知，酶解之后普通肉、暗色肉的灰分、蛋白质、粗脂肪含量均显著减少(p<0.05)，含糖量增加(p<0.05)。DMHP的脂肪含量显著高于OMHP(p<0.05)，蛋白含量小于OMHP(p<0.05)，含糖量则相似(p>0.05)。

表1 圆鲣肌肉组织及其酶解产物的一般营养成分

Tab.1 Proximate nutritional components of muscle tissue from Auxistapeionosoma and its hydrolysates %

表1 圆鲣肌肉组织及其酶解产物的一般营养成分

样品w(灰分)w(粗蛋白)w(粗脂肪)w(糖)OMP5 67±0 1088 76±0 191 50±0 020 50±0 03DMP6 71±0 1781 68±0 085 32±0 100 50±0 02OMHP5 23±0 1476 64±0 121 10±0 048 21±0 27DMHP6 04±0 2170 03±0 164 51±0 178 34±0 39

2.2 氨基酸组成分析

氨基酸组成和序列对其肽的营养和生物活性非常重要。支链氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等)因在动物体内不能合成而必须从食物中摄取，故它们都属于必需氨基酸。支链氨基酸的氧化供能约占到氨基酸供能总量的60%，是主要供能的氨基酸[5]。有研究指出补充支链氨基酸，有利于快速恢复体力，有助于疲劳消除[6-7]，可提高运动能力[8-10]。补充足够的支链氨基酸对运动后恢复有促进的作用，还可加速肌肉的合成，减少肌肉组织的损伤[11]，有助于肌肉增大[12]。动物实验表明，灌胃富含支链氨基酸饮料的小鼠体重增加显著，运动能力增强，抗疲劳和耐缺氧的能力均有明显提高[13]。对圆鲣肌肉组织及其酶解产物的氨基酸组成进行分析，结果见表2。

由表2可知，OMP、DMP、OMHP、DMHP中均检测出18种氨基酸，氨基酸组成齐全。DMHP的氨基酸含量多于OMHP。酶解后，OMP、DMP中的固体蛋白质被水解成可溶性的肽和氨基酸，其中OMHP的氨基酸总量为OMP的75.54%，DMHP的氨基酸总量为DMP的84.15%，这反映了2种不同肉的水解程度，说明此酶解条件下DMP的水解度更高。据FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式，OMHP的E/T、E/N为41.43、70.74，DMHP的E/T、E/N为41.34、70.48，均达到质量较好蛋白的标准。OMP、DMP、OMHP、DMHP中所含的支链氨基酸含量均较高，分别占总氨基酸的18.15%，18.96%，17.75%，18.17%。其中，DMP含量高于OMP，DMHP含量高于DMHP。

2.3 酶解产物分子质量分布测定

现代蛋白质吸收理论证实，多数的蛋白质是经过分解成为不同肽段和氨基酸进而被机体吸收利用的。活性肽比蛋白质和氨基酸更易消化吸收，因为肽类物质可以通过肠上皮细胞被完整吸收，这样就大大缩短了代谢时间[14]。在运动较为剧烈的情况下，补充小肽无疑可以迅速为机体提供能量，补充糖原消耗的不足[15]。另外，补充蛋白水解物可引起促胰岛素效应[16]，可以提高机体对葡萄糖的摄取能力，还可刺激糖原生成，为机体提供更多的能量储备[17]。OMHP和DMHP的分子质量分布结果如图1，分子质量及其占总峰面积的比例见表3。

表2 冻干的圆鲣肌肉组织及其酶解产物的氨基酸组成分析

Tab.2 Amino acid compositions inenzymatic hydrolysate and raw materials of freezing-dryAuxistapeionosomaBleeker %

组成成分OMPDMPOMHPDMHP ω(天冬氨酸)7 256 615 555 78∗ω(苏氨酸)3 603 352 732 84 ω(丝氨酸)3 062 802 332 45 ω(谷氨酸)11 3710 038 668 93 ω(甘氨酸)3 453 372 853 14 ω(丙氨酸)4 554 533 483 86∗ω(缬氨酸)4 003 633 013 11∗ω(蛋氨酸)2 512 241 741 76∗ω(异亮氨酸)3 563 382 632 73∗ω(亮氨酸)6 176 084 494 86 ω(酪氨酸)2 782 371 721 73∗ω(苯丙氨酸)3 123 222 352 54 ω(组氨酸)3 892 422 992 66∗ω(赖氨酸)6 956 075 365 38 ω(精氨酸)4 574 063 183 15 ω(脯氨酸)2 752 922 222 42 ω(胱氨酸)0 500 510 440 43∗ω(色氨酸)1 561 441 331 13 ω(必需氨基酸)31 4729 4123 6424 35 ω(氨基酸总量)75 6469 0357 0658 90 支链氨基酸与氨基酸总量比值18 1518 9617 7518 17 E/T41 6042 6041 4341 34 E/N71 5474 2370 7470 48

*为必需氨基酸，E/T为必需氨基酸与氨基酸总量的比值，E/N为必需氨基酸与非必需氨基酸比值

由图1和表3可知，OMHP和DMHP的分子质量集中分布在1 234～4 498 Da、69～691 Da、44 988～7 951 Da。据峰面积计算其相对含量，结果显示，OMHP和DMHP分子质量在5 000 Da以下的多肽含量最多，都达到30%以上；1 000 Da以下的寡肽也含量丰富，均达到20% 以上，尤其低于700 Da的小分子肽含量很高，OMHP中含22.11%，DMHP中含19.87%。分子质量5 000 Da以下的肽OMHP、DMHP达到了70%。刘晶等[18]将米渣肽灌胃小鼠，发现相对分子质量小于1 000 Da的肽可以显著延缓小鼠的疲劳，其原因是低分子肽可以提高蛋白质的吸收性。因此，酶解产物OMHP、DMHP中的高比例低分子肽对其抗疲劳作用是有正面作用的。

图1 OMHP和DMHP的高效体积排阻色谱Fig.1 HPSEC of OMHP and DMHP

表3 OMHP和DMHP的分子质量分布

2.4 抗疲劳动物实验评价

2.4.1 对小鼠体重的影响

将灌胃两种酶解产物30 d后小鼠的体重与初次灌胃前的小鼠体重进行对比，结果如表4。由表4可知，各实验组及阳性对照组与空白对照组比较，小鼠的体重变化无显著差异(p>0.05)。两实验组内，各剂量之间体重变化无显著差异性(p>0.05)；两实验组间，相同剂量的组体重变化差异不显著(p>0.05)。因此，两实验组的各剂量和阳性对照组对小鼠的体重变化的影响均无统计学意义。但是阳性对照组体重增加量明显低于OMHP的中、高剂量组(p<0.05)，虽也低于DMHP各剂量组，但是与DMHP各剂量组的体重变化差异性不显著(p>0.05)。30 d中，对小鼠的行为进行观察，各组小鼠均精神状态良好，无不良反应和异常行为，表明灌胃圆鲣肌肉酶解产物对小鼠生长并无影响，且无毒副作用。

表4 OMHP和DMHP对小鼠体重的影响

同列数据后小写字母不同者表示差异显著，n=10

2.4.2 对小鼠负重游泳时间的影响

由于负重游泳运动强度大，缺血缺氧相对严重，乳酸水平高，且很快达到力竭性疲劳，因此常用于抗疲劳和耐力测试[19]。

将小鼠连续灌胃不同浓度OMHP和DMHP的30 d后，进行负重游泳实验，结果见表5。

表5 OMHP和DMHP对小鼠负重游泳时间的影响

同列数据后小写字母不同者表示差异显著，n=10

由表5可知，与空白对照组相比，OMHP组和DMHP组均显著(p<0.05)提高了小鼠的负重游泳时间。OMHP、DMHP的低、中、高剂量组与阳性组相比虽然小鼠的负重游泳时间有所延长但差异性不显著(p>0.05)，并且同组的3个剂量组之间的游泳时间也没有显著性差异(p>0.05)。在相同剂量时，DMHP组的游泳时间长于OMHP组，但差异性不显著(p>0.05)。以上结果表明，圆舵鲣普通肉、暗色肉酶解产物均能显著延长小鼠的负重游泳时间，均具有提高小鼠运动耐力的作用，且两组之间差异并不显著。

2.4.3 对小鼠血清尿素氮含量的影响

机体在运动时，体内能量平衡遭到破坏，肌糖原消耗，血糖降低，蛋白质及氨基酸的分解代谢加强。血清尿素氮是蛋白质的代谢产物，在正常生理条件下，蛋白质和氨基酸等含氮物质在分解代谢中先脱下氨基，氨在肝脏转变为尿素，血清尿素氮经血液循环从肾脏排出体外，血清尿素氮的生成和排泄处于平衡状态，使其浓度保持相对稳定；长时间较大强度运动时，不能通过糖和(或)脂肪分解代谢得到足够的能量时，机体本身的蛋白质与氨基酸分解代谢会随之增强[20]。此外，在激烈运动和强体力劳动时，随着核苷酸代谢分解的加强，也会脱氨基而产生氨，并最终使血中血清尿素氮含量增加。可见，血清尿素氮与人身体机能、疲劳程度以及负荷量的大小密切相关，是评价人体运动负荷能力的敏感指标。因此评价抗疲劳活性时，小鼠体内血清尿素氮含量比空白对照组少的实验组可认为其灌胃物具有抗疲劳效果。

采用1.2.5节方法，对OMHP和DMHP灌胃后的小鼠血清尿素氮含量进行测定，结果见图2。

由图2可知，与对照组相比，OMHP组、DMHP组小鼠运动后血清尿素含量低于空白组，且各剂量组与空白组间均存在显著性差异(p<0.05)。OMHP、DMHP 两组中的中、高剂量组血清尿素氮含量均小于阳性对照组，且差异性显著(p<0.05)。同组的不同剂量之间，随着剂量增加，尿素氮含量减小，呈现剂量依赖性，除OMHP 组的中剂量组与高剂量组差异不显著外(p>0.05)，其余差异性显著(p<0.05)。OMHP、DMHP 两组间相同剂量对比，OMHP组的尿素氮含量小于DMHP组，但差异性不显著(p>0.05)。OMHP的中、高剂量均优于阳性对照组，且差异性显著(p<0.05)。因此可以认为，两实验组的高剂量在此指标下稍优于阳性对照组。OMHP组高、中剂量组要明显优于低剂量组(p<0.05)，DMHP组随剂量增高抗疲劳效果明显更好(p<0.05)。因此，但从血清尿素氮指标看来，OMHP组较优的剂量可认为是中剂量，DMHP组较优剂量可认为是高剂量。

2.4.4 对小鼠肝糖原含量的影响

肝脏和肌肉中的葡萄糖以糖原形式存在，糖原是葡萄糖在机体内的主要贮存形式。血液中的葡萄糖又称血糖，随血液流经机体各个组织，以供给这些组织的需要。能量运动最初是来自肌糖原分解，力竭运动后，肌糖原作为运动产能物质，含量约降低 95%。后来则由肝脏释放葡萄糖供能[21]。肝脏是血液中葡萄糖最重要的调节器官，有75%左右的内源性葡萄糖来源于肝糖原分解，仅有5%来源于糖异生作用[22]。由于糖原在有氧代谢和无氧代谢中都会被迅速降解产生ATP，因此糖原是力竭运动中能量的主要来源[23]。机体在进行短时间大强度的运动时，肌肉组织的能量大部分由糖代谢供给。由于血糖浓度降低，为了维持一定的血糖浓度导致肝糖原大量分解，可使肝糖原的排空程度达75%以上，并造成运动后期的低血糖，使运动功能不足引起疲劳，因此肝脏和肌肉中的糖原含量成为评价疲劳程度的重要参数[24]。运动能力的增强可以用肝脏和肌肉中的糖原降解水平降低来解释[25]。因此，评价抗疲劳效果时，小鼠的肝糖原含量比空白组高的可认为有抗疲劳效果。

小写字母不同者表示差异显著，n=10

采用1.2.5节方法，对OMHP和DMHP灌胃后的小鼠肝糖原含量进行测定，结果见图3。由图3可以看出，经灌胃30 d后，OMHP组和DMHP组的小鼠运动后肝糖原含量均显著高于空白对照组，两组各剂量与空白对照组比较有差异显著(p<0.05)，由此可判定该试验结果为阳性，即可判定南海圆舵鲣普通肉酶解产物和暗色肉酶解产物各剂量均具有增加肝糖原贮备，或减少运动中肝糖原消耗的作用。与阳性对照组相比，两组的不同剂量组之间虽然肝糖原含量均大于阳性对照组，但差异性不显著(p>0.05)。并且OMHP组与DMHP组的不同剂量组之间肝糖原含量均无显著差异性(p>0.05)。

3 结 论

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(责任编辑：李 宁)

Preliminary Study on Antifatigue Activity of Enzymatic Hydrolysate ofAuxistapeionosomaBleeker from South China Sea

ZHANG Chaohua1，2, SU Yang1, CAO Wenhong1, LU Hongyu1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology/GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAquaticProductProcessingandSafety,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088,China；2.SouthChinaSeaBio-ResourceExploitationandUtilizationCollaborativeInnovationCenter,Guangzhou510275,China)

AuxistapeionosomaBleeker is a kind of tuna in the South China Sea with high yield and low value. This study analyzed the proximate composition, amino acid composition of the ordinary meat and dark meat hydrolysates, and evaluated their anti-fatigue activity by animal experiment. The total amino acids of the ordinary muscle hydrolysate powder (OMHP) and dark muscle hydrolysate powder (DMHP) ofAuxistapeionosomaBleeker were 57.06% and 58.90%, respectively. The branched chain amino acids accounted for about 18% of the total amino acids. The contents of the components in OMHP and DMHP with molecular weight below 5 000 Da were both up to 70%, and the content of below 700 Da was both more than 20%.Compared with the control group, the OMHP and DMHP could significantly prolong the swimming time of mice (p<0.05), increase liver glycogen reserves of mice (p<0.05), and lower the serum urea nitrogen in mice after exercise (p<0.05). It showed that both had anti-fatigue activity, and there was no significant differences between them. The results showed that the OMHP and DMHP ofAuxistapeionosomaBleeker from South China Sea could be used as potential anti-fatigue health care products.

AuxistapeionosomaBleeker; ordinary muscle; dark muscle; enzymatic hydrolysis; anti-fatigue activity

2017-01-03

广东省农业科技团队项目(2011A020102005)；广东省科技计划项目(2014B020204001)。

章超桦，男，教授，主要从事海洋生物资源高值化利用方面的研究。

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.01.007

2095-6002(2017)01-0043-07

章超桦，苏阳，曹文红，等. 南海圆鲣肌肉组织酶解产物抗疲劳活性的初步研究[J]. 食品科学技术学报，2017,35(1):43-49. ZHANG Chaohua, SU Yang, CAO Wenhong, et al. Preliminary study on antifatigue activity of enzymatic hydrolysate ofAuxistapeionosomableeker from south China sea[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(1):43-49.

TS254.2

A