星点设计-响应面法优化知母总皂苷提取工艺

孙士林(西北民族大学 化工学院， 甘肃 兰州 730030)

星点设计-响应面法优化知母总皂苷提取工艺

孙士林(西北民族大学 化工学院， 甘肃 兰州 730030)

目的：采用星点设计-响应面法优化知母总皂苷提取工艺。方法：以知母皂苷元为指标，选取乙醇作为提取溶剂，以乙醇浓度、固液比、提取时间、提取次数为自变量，知母总皂苷提取效率为因变量，采用星点设计-响应面法对知母总皂苷提取工艺参数进行优化。结果：确定了知母总皂苷提取最佳条件：乙醇浓度70%、固液比1:6、提取时间75分钟、2次提取为最优条件。结论：该工艺可用于知母总皂苷提取，工艺流程简单，预测性好。

知母；响应面法；星点设计；知母总皂苷；提取工艺

中 药 知 母 为 百 合 科 植 物 知 母(Anemarrhenaasphodeloides Bge.)的干燥根茎，史载于《神农本草经》，具有清热泻火、生津润燥的功效，用于治疗温热病，邪热亢盛、壮热、烦渴[1]。知母为常用大宗“道地”中药材,产自河北历县，习称“西陵知母”。知母根茎中含大量甾体皂苷，已分离鉴定出多种皂苷。知母总皂苷元能明显降低衰老小鼠脑β受体cAMP系统的反应性，重现知母的下调作用，是由知母药材经水解提取精制而成[2]。目前对知母的利用基本上停留在作为处方药材进行简单的丸剂、散剂、制剂加工，对于其中有效成分知母总皂苷元的提取、纯化以及加工利用程度还远远不够。

知母总皂苷提取工艺的工业化生产有深远的意义,深圳太太药业股份有限公司近年已将知母皂苷元开发成为一个中药二类新药，主要治疗现代医学中老年痴呆症和学习、记忆减退或某些性格改变等脑功能减退症状，因此,就目前而言，知母总皂苷提取方法有：大孔树脂吸附法母制剂[3]、水解法[4]、膜分离法[5]以及溶剂提取法，前四种方法虽然相对溶剂提取法而言有提取效率高、纯度大的优点但其成本造价太高、操作相对繁琐不适宜工业生产采用，因此溶剂提取法仍然作为现如今知母皂苷生产常用方法。知母皂苷化合物分子量较大,易溶于热水、乙醇等极性溶剂[6]，就知母皂苷提取而言，知母皂苷受提取条件影响大，故而筛选出最优条件对知母皂苷生产有重要意义。本实验采用星点设计对知母总皂苷提取工艺外部条件进行筛选，再结合Design-Expert 8.0.6软件进行电脑模拟预测，回归现实实验验证，筛选出知母总皂苷提取条件，为知母的开发及工业化提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

西陵知母(产自河北易县)，知母皂苷元标准品(含量98%，购自上海谱振生物科技有限公司，批号：ZY161102)，乙醇、甲醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均为国产市售AR级试剂。

1.2 仪器

电子分析天平(FA1204B上海精科)，紫外可见分光光度计(Heλiosβ 美国热电)，旋转蒸发仪(RE-52C 常州诺基)，水浴锅。

2 方法与结果

2.1 知母总皂苷含量测定

2.1.1 对照溶液制备

取知母皂苷元标准品适量，加甲醇定容至50ml棕色容量瓶留用。

2.1.2 供试品溶液制备

取干燥知母根茎，粉碎，过20目药筛，取10g知母粉，加入60ml70%乙醇，精密称重并于60℃水浴回流提取1h，补足重量，提取液过滤，取10ml浓缩至干，取分析纯溶剂溶解并定容至100ml容量瓶。于10ml容量瓶中添加0.2ml高氯酸、0.8ml5%香草醛-冰醋酸溶液，以上述溶液进行定容，60℃恒温水浴显色20min，取出立即冰浴5min，静置10min，于430nm波长处测量吸光度A。

2.1.3 最大吸收波长的确定[3]

精密吸取2.1.1中知母皂苷元对照溶液，采用2.1.2中显色方法进行显色，以试剂为空白对照，在200-1000nm波长范围扫描，结果为430nm处吸光度最大，故以430nm为最大吸收波长。

2.1.4 标准曲线制备[4]

精密移取标准品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml于10ml容量瓶，按照2.1.2显示方法进行显色，以无水甲醇进行定容。以无水甲醇按照上述方法进行显色最为对照。于430nm波长处测定紫外吸收。标准品加入量为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程。

2.1.5 稳定性试验

取同一样品按照2.1.3进行操作，每隔10min测定一次，结果表明在30min内同一样品测定结果基本稳定。

2.1.6 精密度试验

取5份同一样品，按2.1.2操作方法进行紫外吸收测定，连续进样5次，测定其RSD值为1.0%，结果表明本方法精密度好。

2.1.7 重现性试验

按2.1.2操作平行制备5份样品，每份吸取1.0ml，测定紫外，RSD值为1.1%，表明重现性好。

2.1.8 回收实验

取已知知母总皂苷含量的知母粉5份，每份10g，分别加入适量知母皂苷元对照品，进行回流提取，滤液定容至10ml容量瓶。按2.1.2处理，并且显色。结果显示知母总皂苷的平均加样回收率为98.2%。

2.2 单因素实验

2.2.1 提取溶剂浓度对知母总皂苷提取的影响

按照2.1.2操作，分别取溶剂浓度50%、60%、70%、80%、90%，固液比1:6，提取1次，提取60min，并按照2.1.2显色、测定紫外吸收。

测定结果如图1所示，通过图一可以看出当乙醇浓度上升时，知母总皂苷提取率上升，当上升到一定程度时开始下降，最适浓度为70%，此时知母总皂苷提取效果最优，提取率为64.2mg/g。

图1 乙醇浓度对提取率影响

2.2.2 固液比对知母总皂苷提取的影响

选取乙醇浓度70%，提取时间为60min，提取一次，固液比分别取1:3、1:4,、1:5、1:6、1:7、1:8、1:10，按照2.1.2操作进行提取以及显色。测定知母总皂苷提取率，随着固液比的上升，知母总皂苷提取效果呈现上升趋势，当固液比1:6时，知母总皂苷提取率随着固液比增加提取效果变化最大。当固液比超过1:6时，知母总皂苷提取效果变化趋势不大，从节约成本考虑，固液比1:6为最适固液比。

2.2.3 提取次数对知母总皂苷提取影响

选取乙醇浓度70%、固液比1:6，提取时间为60min，提取次数分别为1、2、3、4、5次，按2.1.2操作进行处理及显色。测定知母总皂苷提取率，随着提取次数的增加，知母总皂苷提取效果在1到2次时变化最为明显，在3次以后变化趋势不明显，故而可以认定提取次数为2次时知母总皂苷提取效率最优。

2.2.4 提取时间对知母总皂苷提取影响

选取乙醇浓度70%、固液比1:6，提取次数2次，提取时间分别为30、60、90、120、150min，按2.1.2进行处理及显色操作。测定知母总皂苷提取率，随着提取时间的增加，知母总皂苷提取效果相对应产生变化，在提取时间大约为80min时，知母总皂苷提取效果达到最大，当提取时间再次增加时，提取效率反而下降。因此确定知母总皂苷提取时间80min最佳。

图3 提取次数与提取率

2.3 响应面法优化知母总皂苷提取率

根据星点实验设计，选取提取溶剂浓度、提取次数、提取时间为三个考察因素，以知母总皂苷提取率为因变量，以Design-Expert 8.0.6软件实验设计的三因素三水平实验方案进行研究。

表2 实验因素水平编码

图4 星点设计及结果

2.3.1 模拟方程建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对上表数据进行方差分析，得回归方程：Y=-351.48733+6.52578*X1+132.86326X2 +2.12981*X3-0.29400*X1X2--003*X1 *X3+0.021960*X2*X3-0.032937* X12-25.30811* X22-003*X32。其中，方程中各变量对响应值影响的显著性可从F检验，prod>F值越小，则相应的显著程度越好。

2.3.2 工艺参数优化与预测

根据响应面软件实验设计所得结果计算出最佳提取工艺条件：乙醇浓度70%，提取次数2次，提取时间75min。(分析结果见附图)

2.3.3 实际验证试验

根据响应面软件预测结果，进行5次最佳条件下的提取验证，结果表明，知母总皂苷提取率达到150.337mg/g，相比于预测结果降低1.231%，表明结果达到模型预测效果。

3 讨论

本实验通过对提取溶剂浓度、提取时间、提取次数、固液比单因素对知母总皂苷提取率影响的考察，确定主要影响因素，利用Desig Expert 8.0.6 软件进行响应实验设计，进行试验预测，通过实际验证确定了知母总皂苷最佳提取工艺：乙醇浓度70%，提取两次，提取75min为最佳提取条件，单因素实验确定了最佳固液比1:6。整个提取工艺流程简单，提取率高，可为后续知母产业工业化提供理论依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2015.205-206.

[2]赵树进，韩丽萍，李俭洪.知母皂苷及其苷元对动物模型β肾上腺素受体的调整作用[J].中国医院药学杂志，2000，20(2)：70-73.

[3]韩丽萍，赵树进，李俭洪，大孔树脂法提取知母总皂苷[J].中药材，2004，27(4)：288-289.

[4]陈丛瑾，黄克瀛，岗建伟，等.知母总皂苷元的提取工艺研究[J].应用化学，2007，36(2)：87-88.

[5]吴妍.知母提取物的提取及制剂工艺研究[J].广东:广东药学院，2008，5.

[6]高帅.知母活性成分提取工艺优化及降糖活性研究[D].杭州：浙江工业大学，2013.

附图