新型液体婴儿配方乳对小鼠免疫功能的影响

付 莉,岳喜庆

(1.锦州医科大学,辽宁锦州 121001;2.沈阳农业大学,辽宁沈阳 110161)

新型液体婴儿配方乳对小鼠免疫功能的影响

付 莉1,岳喜庆2

(1.锦州医科大学,辽宁锦州 121001;2.沈阳农业大学,辽宁沈阳 110161)

本文研究新型液体婴儿配方乳对免疫抑制小鼠免疫功能的影响,利用腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制小鼠模型,将昆明小鼠分为5组,每组10只,经口灌胃给予小鼠0、1、2、4 g/kg·bw新型液体婴儿配方乳连续喂养28 d。分别对小鼠免疫器官脏体比值、刺激指数、抗体生成细胞情况、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、NK细胞活性进行探讨。与模型对照组相比,高、中剂量组能显著增加(p<0.05)小鼠刺激指数、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬、小鼠NK细胞活性,各剂量组能显著增加(p<0.05)小鼠肝脏和胸腺指数、抗体细胞的OD413 nm。结果表明，新型液体婴儿配方乳对免疫抑制小鼠有一定免疫增强作用。

液体婴儿配方乳,免疫抑制,小鼠,免疫功能

婴儿时期是体格、免疫、心理、生长、发育快速发展时期,这个时期如果低摄入营养素或者营养素生物利用减少均可能导致婴儿先天不足、发育迟缓、引起身体技能障碍[1-2],增加心脏病、高血压、糖尿病和肥胖发病率[3-4]。因此,提供合理膳食对婴儿健康生长至关重要。

液体婴儿配方乳是一种乳基液体婴儿配方食品,和其他婴儿配方食品相比,具有安全、方便、营养全面的特点。目前国内市场上,乳基婴儿配方食品主要是婴儿配方乳粉,而相当多的产品中乳蛋白质未经修饰和处理,部分婴儿食用后会出现消化不良和过敏等症状。已有研究报道,乳蛋白水解物具有提高免疫力、调整肠道菌群、促进铁吸收等功能[5-7],因此,将乳水解液与大豆蛋白质和其它原辅料进行复配,研制出一种低致敏性、易消化、具有免疫调节作用,营养成分和作用接近母乳的,稳定的,适合1岁以内婴儿食用的新型液体婴儿配方乳。而本文侧重进一步对这种新型液体婴儿配方乳的免疫调节作用进行探讨,为其应用及后期配方改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛乳 采自沈阳辉山牧场;乳糖、脱盐乳清粉、二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸(AA)、牛磺酸、核苷酸、左旋肉碱低聚果糖、低聚半乳糖 大庆乳品有限责任公司提供;紫苏籽油 辽宁晟麦实业股份有限公司;葵花籽油 中粮东海粮油工业有限公司;棕榈酸酯 东莞市宏海油脂有限公司;椰子油 Team Asia Corporation;大豆油 哈尔滨九三油脂有限公司;茶花油 湖南金浩茶油股份有限公司;分子蒸馏单甘酯、κ-卡拉胶 连云港友进食品添加剂技术开发有限公司;SE-15蔗糖脂肪酸酯 柳州爱格富食品科技股份有限公司;卵磷脂 德国嘉吉公司;海藻酸丙二醇酯 无锡市百瑞多化工产品有限公司,以上均为食品级;健康活鸡血 锦州市售;靶细胞K562 锦州医科大学提供;试剂盒-细胞培养液Hank’s平衡盐溶液 天津子涵生物科技有限公司;刀豆蛋白A(CoA)、RPMI-1640培养基 北京钮因华信科技发展有限公司;噻唑蓝(MTT) Amresco;二甲基亚砜 天津市永大化学试剂有限公司;绵阳血 郑州百基生物科技有限公司;硝基氯化四氮唑蓝 上海源叶生物有限公司;氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐 Sigma公司;昆明小鼠 清洁级,体重20～22 g;雄性豚鼠 清洁级,体重300～320 g,均由锦州医科大学实验动物中心提供。

DU-65D高精度恒温水浴槽 杭州蓝天仪器有限公司;JJ高压均质机 廊坊市盛通机械有限公司;HZ实验型超高温杀菌机 上海辉展实验设备有限公司;FA2004N电子天平 上海荣志公司;755B紫外-可见分光光度计 上海精密仪器公司;TDL-40B离心机 江苏金坛恒丰制造有限公司;BPX-52恒温培养箱 上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液体婴儿配方乳制备工艺 100 mL牛乳加入0.15%碱性蛋白酶先水解30 min,再加入0.25%风味蛋白酶水解10 min后,90 ℃灭酶10 min制得牛乳水解液。将31.35 g牛乳水解液,7.26 g脱盐乳清粉,0.104 g大豆分离蛋白,2.32 g混合油脂(大豆油20%,棕榈油50%,葵花籽油17%,紫苏籽油2%,茶花油8%),0.8 g低聚糖与低聚半乳糖混合物(1∶8),5 mg牛磺酸,2.8 mg核苷酸,1.5 mgL-肉碱,30 mg DHA,40 mg AA,0.05 g复合维生素,0.3 g复合矿物质,0.07 g蔗糖脂肪酸酯,0.06 g单甘酯,0.37 g卵磷脂,0.04 g卡拉胶,0.02 g海藻酸丙二醇酯混合,加水定容至100 mL。控制压力25～35 MPa,温度50 ℃,均质二次。均质溶液放入超高温瞬时杀菌器中灭菌后无菌灌装,放入4 ℃冰箱中保存,备用。

1.2.2 昆明小鼠分组及给药 选择昆明小鼠50只,随机分为5组,每组10只,雌雄各半。分别为空白对照组(生理盐水)、婴儿配方乳高剂量组(4 g/kg·bw)、婴儿配方乳中剂量组(2 g/kg·bw)、婴儿配方乳低剂量组(1 g/kg·bw),模型对照组(生理盐水),每日清晨灌胃1次,0.2 mL/10 g,连续灌胃28 d。期间自由进食基础饲料、自由饮水。除空白对照组外,其他实验组小鼠每两天腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg·bw。

1.2.3 小鼠免疫器官脏体比值测定 取脾脏和胸腺,去除筋膜,用滤纸吸干表面液体,置于分析天平上测量脾脏和胸腺的重量。利用公式计算脾脏指数和胸腺指数[8]。

1.2.4 小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法) 剖开左腹腔,取出脾脏,放入含5 mL无菌Hank’s液培养皿中,用镊子和针破碎脾脏,制成单细胞悬液,过滤,Hank’s液清洗,1000 r/min离心10 min,重复三次,取100 μL细胞液,稀释后,放在细胞计数板上进行细胞计数,调整细胞浓度为1×105个/mL。

淋巴细胞增殖反应:转移12份1×105个/mL脾细胞悬液100 μL分别至96孔培养板中,其中6个孔加入100 μL含有ConA的RPMI-1640培养液(终浓度为5 μg/mL),另外6个孔作为对照组加入100 μL不含有ConA的RPMI-1640培养液。再选6个孔只加入100 μL RPMI-1640培养液作为空白组,18个样品置于5%CO2,37 ℃培养箱中培养4 h,反应后18孔中分别加入10 μL 5 mg/mL MTT液,继续培养6 h后,弃去上清,每孔加入100 μL二甲基亚砜,30 min内充分混匀,于570 nm下测定各样品的吸光值。利用公式计算刺激指数,判断淋巴细胞增殖情况[9]。

1.2.5 抗体生成细胞检测 采用定量溶血分光光度法,将小鼠腹腔去毛,实验结束前5 d,消毒后,注射0.2 mL 2%的绵阳红细胞致敏,第28 d给药后,处死小鼠,取小鼠脾脏,制成浓度为5×106个/mL的脾细胞悬液。

绵羊红细胞制备:取新鲜绵羊血,用生理盐水洗涤,2000 r/min离心,除去上清液,重复两次,收集绵羊红细胞,用生理盐水将绵羊红细泡稀释成1.5×108个/mL,现用现制。

补体的制备:雄性豚鼠,实验室饲养5 d后,心脏取血,3000 r/min离心15 min,血清备用。取5 mL豚鼠血清加入1 mL 2%绵羊红细胞,混合后4 ℃放置30 min,3000 r/min离心15 min,上清用生理盐水1∶10稀释备用。

抗体形成细胞检测:将实验组、空白对照组、模型对照组的小鼠的脾细胞液1 mL加入1 mL绵羊红细胞和1 mL补体,同时制备对照管,为1 mL Hank’s液加入1 mL绵羊红细胞和1 mL补体,各样品分别混匀后,37 ℃孵育1 h,3000 r/min离心5 min,取上清,在413 nm测定吸光度。[10]

1.2.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 第20 d,小鼠腹腔去毛,消毒,无菌注射灭菌的6%淀粉溶液1 mL,第24 d,腹腔注射1 mL 1%鸡红细胞悬液,并轻揉腹部使鸡红细胞分散。30 min后,处死小鼠,剖开腹腔,吸出腹腔液于试管中,用吸管吸取一滴滴于载玻片上,均匀涂开,37 ℃培养30 min。用生理盐水漂洗,自然干燥,1∶1丙酮甲醇溶液固定,4% Giemsa-磷酸缓冲液染色3 min,蒸馏水漂洗后晾干。盖上盖玻片,于显微镜下观察。用每100个巨噬细胞中,吞噬鸡红细胞的巨噬细胞百分率表示吞噬率，吞噬率用以下公式计算[10]。

吞噬率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100

1%鸡红细胞悬液制备:取健康活鸡血液5 mL,加入20 mL Alsever溶液,混合均匀后4 ℃冰箱保存备用。取混合鸡血溶液5 mL,加入8 mL 0.85% NaCl溶液,1500 r/min离心5 min,反复洗3次,配制成1%鸡红细胞悬液。

1.2.7 NK细胞活性测定(LDH释放法) 效应细胞悬浮液制备:小鼠脾细胞悬浮液制备同1.2.4 制备出的脾细胞用RPMI-1640完全培养液将脾细胞浓度调整为2×107个/mL。

靶细胞液制备:将靶细胞K562活化培养24 h,用生理盐水洗涤,1000 r/min离心10 min,重复3次,用完全RPMI-1640培养液将靶细胞浓度调整为1×105个/mL。

LDH底物溶液的制备:称取硝基氯化四氮唑蓝4 mg,氧化型辅酶Ⅰ 10 mg,吩嗪二甲酯硫酸盐1 mg,双蒸水2 mL,1 mol/L乳酸钠0.4 mL,0.1 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液定容至10 mL。

取效应细胞和靶细胞各100 μL加入96孔细胞培养板的孔中,每个样品设置3个复孔,同时设置靶细胞自然释放组和最大释放组,靶细胞释放组为100 μL靶细胞加入100 μL RPMI-1640培养液,最大释放对照组为100 μL靶细胞加入100 μL 1% NP-40溶液,96孔细胞培养板置于37 ℃预温10 min,各孔分别加入LDH底物溶液100 μL,37 ℃避光反应15 min。各孔加入30 μL 1 mol/L柠檬酸溶液终止反应。用酶标仪在570 nm波长下测定各样品的吸光值[11]。NK细胞活性利用下式计算:

NK细胞活性(%)=[(实验组吸光度-自然释放组吸光度)/(最大释放组吸光度-自然释放组吸光度)]×100

1.2.8 数据统计 实验中数据均通过三次平行实验获得,实验数据用三次实验数据平均值与标准差来表示,SPSS20.0软件用于对数据进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 小鼠免疫器官脏体比值

表1 液体婴儿配方乳对小鼠免疫器官重量的影响Table 1 Influence of liquid infant formula milk on the weight of immune organ

注:同一行标识不同字母,表示差异显著(p<0.05);表2～表5同。

表2 液体婴儿配方乳对小鼠刺激指数的影响Table 2 Influence of liquid infant formula milk on the SI of mices

表3 液体婴儿配方乳对抗体形成细胞的影响Table 3 Influence of liquid infant formula on the antibody-forming cell

从表1可知,与空白对照组相比,其他组别小鼠的肝脏和胸腺指数显著(p<0.05)降低,说明环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠模型成功,而与模型对照组相比,中、高、低剂量组的小鼠的肝脏和胸腺指数显著(p<0.05)升高,而中、高、低剂量组之间小鼠肝脏和胸腺指数差异不显著,说明实验制婴儿配方乳对小鼠的免疫器官增长具有一定的促进作用。

2.2 小鼠脾淋巴细胞转化实验

从表2可知,与空白对照组相比,模型对照组的小鼠刺激指数显著降低,说明ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖被显著抑制,免疫力低下小鼠模型建立成功。而与模型对照组相比,高、中剂量组小鼠的刺激指数显著(p<0.05)增加,而低剂量组与模型对照组相比,差异不显著,因此一定量的实验制液体婴儿配方乳对小鼠淋巴细胞具有一定的增殖作用,但与空白对照组相比,刺激指数仍下降显著(p<0.05),无法恢复至初始的水平。

2.3 抗体生成细胞检测

从表3可知,与空白对照组相比,模型对照组的小鼠的抗体形成细胞的OD413 nm显著(p<0.05)降低,说明低免疫活性小鼠模型建立成功。与模型对照组相比,低、中、高剂量组小鼠的抗体细胞的OD413 nm显著(p<0.05)增加,且与空白对照组相比,差异不显著。淋巴系细胞有B细胞和T细胞,这两种细胞都可以转换为抗体形成细胞,因此,实验制液体婴儿配方乳有利于抗体形成细胞的生成,调节机体免疫功能。

那天的黄昏是记忆中最美的，在清澈流淌的小河边，一个简陋而又能遮风雨的棚，雨后的斜阳渗着无力的光，透过棚架，映在烟雾缭绕的方寸之地，生成了冷抽象的分割。昏暗中有人挂起了明亮的气灯，灯在风中摇曳，在动感的灯光与太阳的余晖交相掩映的瞬间，我看到了人们粗犷而善良的眼神，闪烁在惊喜的空间，那氛围使人突然迸发出一种让人毕生难忘的感动。

2.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

从表4可知,与空白对照组相比,模型对照组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬率显著(p<0.05)降低,说明免疫力低下小鼠模型建立成功。与模型对照组相比,中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率显著(p<0.05)升高,而低剂量组与模型对照组相比,差异不显著。当病原物或其他异物侵入机体时,能招引巨噬细胞,杀死病原物并将其消化分解。因此,一定浓度的实验制液体婴儿配方乳具有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用,提高机体免疫功能。

表4 液体婴儿配方乳对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响Table 4 Influence of liquid infant formula milk on the phagocytic rate of macrophage cell in abdominal cavity of mice

表5 液体婴儿配方乳对小鼠NK细胞活性的影响Table 5 Influence of liquid infant formula milk on the activityof NK cell in mice

2.5 NK细胞活性测定

从表5可知,与空白对照组相比,模型对照组的小鼠NK细胞活性显著(p<0.05)降低,免疫力低下小鼠模型建立成功。与模型对照组相比,中、高剂量组小鼠NK细胞活性显著(p<0.05)升高,低剂量组小鼠NK细胞活性差异不显著。而中、高剂量组之间差异不显著,且均与空白对照组差异不显著,可见实验制液体婴儿配方乳可增加免疫力低下小鼠的NK细胞活性,且与正常食用饲料的小鼠的NK细胞活性相近。

3 结论

本实验测定了液体婴儿配方乳对小鼠免疫功能的影响,结果显示其对小鼠器官免疫作用、细胞免疫作用、体液免疫作用、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性均具有一定的调节作用,对提高机体免疫力有一定作用。

与其他同类研究相比,本研究中的液体婴儿配方乳对提高免疫抑制小鼠的免疫作用更显著,这和产品的配方有关。由于本产品中含有牛乳蛋白肽、蛋白质、各种微量元素、低聚糖,而具有一定的免疫作用。产品中牛乳蛋白小肽的浓度提高,与其免疫活性提高有一定的相关性。因此,进一步研究牛乳蛋白的水解技术,将小肽应用于婴儿配方乳中是提高液体产品免疫作用的关键技术。

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Effect of new liquid infant formula milk on mouse’s immunity function

FU Li1,YUE Xi-qing2

(1.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China;2.Shenyang Agriculture University,Shengyang 110161,China)

In this paper,the effect of new liquid infant milk on immunosuppressive mouse’s immunity function was determinated,Kunming mouses were intraperitoneally injected of cyclophosphamide and divided into 5 groups,each group included ten mouses. Mice were administered 0,1,2,4 g/kg·bw new liquid infant milk for 28 days,and immune organ dirty body ratio,stimulate cell index,antibody generation,rate of macrophage cell in abdominal cavity of mice,NK cell activity were investigated respectively. Compared with model control group,high,middle dose group could significantly increase(p<0.05)stimulus index,rate of macrophage cell in abdominal cavity of mice,NK cell activity,each dose group could significantly increase(p<0.05)liver and thymus index,the OD413 nmof antibody cell. New liquid infant formula milk had immunity function for immunosuppressive mice.

liquid infant formula milk;immunosuppressive;mice;immunity

2016-08-09

付莉(1979-)，女，博士，研究方向：乳品加工，E-mail:fuli1979119。

TS252

A

:1002-0306(2017)04-0357-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.059