寡雄蛋白处理对马铃薯块茎活性氧代谢及病程相关蛋白的诱导

2017-03-14潘静宇李永才高春丽

食品工业科技 2017年4期

关键词：几丁质块茎马铃薯

杨兰,潘静宇,李永才,刘筱,高春丽,毕阳

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

寡雄蛋白处理对马铃薯块茎活性氧代谢及病程相关蛋白的诱导

杨兰,潘静宇,李永才*,刘筱,高春丽,毕阳

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

马铃薯块茎,寡雄蛋白,活性氧代谢,病程相关蛋白

2015年中国农业部正式提出推动马铃薯主粮化,这为马铃薯产业的发展提供了良好的契机[1],但是也存在其他问题,尤其因目前采后贮藏设施落后、管理粗放而造成的烂窖现象严重影响马铃薯加工原料的供给和采后增值,其中马铃薯在采后贮藏期间因病原微生物侵染而发生腐烂的高达20%～25%[2]。虽然化学农药在一定程度上可以减缓病害的发生,但是存在农药残留、环境污染和抗病菌株等问题,因此,需要一种安全有效的病害控制技术来减少或逐步取代化学农药的使用。近年来,诱导植物抗病性成为研究热点,许多因子都能诱导植物的抗病反应,其中生物防治以其安全性、有效性成为目前采后病理学的研究热点[3]。

寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)能够产生分子量约为10 ku的拟激发子蛋白,Picard将其命名寡雄蛋白(oligandrin),它是一种与激发子有相似功能的信号传导蛋白,能够激发植株的抗病性防御反应[4]。自从被发现以来,寡雄蛋白作为拟激发素引起了人们极大的注意,成为近年来真菌生物激发子研究的热点之一。寡雄蛋白能够对其他多种致病腐霉(Pythiumspp.)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersi)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)所引起的多种重要蔬菜病害产生系统抗性[4]。

植物在受到外源激发子诱导后会有两类反应,一类是快速的局部反应,即过敏反应(Hypersensitive Response,HR),另一类是诱发了植物一系列的防御反应,使作物产生全面的抗性,即诱导系统抗性(Induced Systematic Resistance,ISR)[5]。植物体内所产生的病程相关蛋白和防御酶系都与植物的抗病性息息相关,可作为植株抗性的重要生理指标。研究发现,寡雄蛋白能够诱导番茄植株的防御反应,在病原菌侵入处形成富含胼胝质的细胞壁沉积物和胞间阻塞,而且在侵染部位还会大量积累真菌毒素,从而抑制寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)的侵染和定殖[6]。前期的研究结果表明24 μg/mL寡雄蛋白处理能有效的降低马铃薯块茎干腐病的扩展,但其具体的作用机理尚待进一步研究。因此,本研究以甘肃马铃薯“新大坪”为试材,从活性氧代谢的角度探究寡雄蛋白处理诱导果实抗病反应的机理,为采后马铃薯病害控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“新大坪”马铃薯购于甘肃省定西市安定区,挑选无病害、大小均匀的马铃薯,运抵实验室后在5～8 ℃条件下贮藏备用;多利维生寡雄腐霉(Pythiumoligandrum) 北京比奥瑞生物科技有限公司提供;硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum) 分离纯化自感病的马铃薯块茎;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸羟胺分析纯,天津市大茂化学试剂厂;交联聚乙烯毗咯烷酮(PVPP)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、二硫苏糖醇(DTT) 北京索莱宝科技有限公司;对氨基苯磺酸、α-萘胺天津市光复精细化工研究所;盐酸、丙酮、H2O2分析纯,成都市科龙化工试剂厂。

UV-2450紫外-可见分光光度计日本岛津;H1850R台式高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司;LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;DHP-9272B型恒温培养箱上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 寡雄蛋白滤液的制备参照Wang等[7]的方法并进行改进。将配制好的液体培养基分装到50 mL的三角瓶中,121 ℃灭菌30 min。每瓶接入直径8 mm活化的寡雄腐霉菌丝块8块,于25 ℃、150 r/min下暗培养7 d,培养液经8000 r/min离心10 min,上清液用4层无菌滤纸过滤,即得无菌发酵液,浓度为100%,置于4 ℃冰箱中备用。寡雄腐霉液体培养基简称PO培养液,配方参照王爱英[8]所描述的方法进行配制。

1.2.2 寡雄蛋白的提取、纯化在得到的寡雄腐霉滤液中边加固体硫酸铵边搅拌,加至硫酸铵最终浓度为50%,4 ℃静置过夜,10000×g离心15 min,沉淀保存于-20 ℃备用;上清液中再加固体硫酸铵至60%(所有方法同上),依次类推,一直加到100%[9],每级收集的沉淀用双蒸水溶解,装入分子截留量为8 ku的透析袋中,放在生理盐水中透析48 h以除去盐类物质,期间更换生理盐水数次,用0.2% BaCl2检测硫酸铵是否除去。吸取透析袋中液体,剩余沉淀即为寡雄蛋白。

1.2.3 寡雄蛋白对马铃薯块茎的诱抗作用挑选外观整齐、无病虫害的马铃薯块茎,自来水清洗后,用2%的次氯酸钠溶液浸泡2 min进行表面消毒,然后用无菌水冲洗后自然晾干,随后再用75%酒精表面消毒,最后用灭菌铁钉(直径3 mm)在块茎赤道部位均匀刺3 mm×3 mm的伤口3个,之后用移液枪接种10 μL 56、24、18、12、6 μg/mL寡雄蛋白,诱抗12 h后的块茎分别接种10 μL硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum)孢子悬浮液,对照接种10 μL无菌水,之后用塑料袋包装,在室温条件下贮藏并测定不同时期的病斑直径。每个浓度3个块茎,重复3次。

1.2.4 取样方法参照Bi等[10]的方法并稍作修改。将马铃薯制成马铃薯切片,用本实验室前期筛选出的最佳质量浓度的寡雄蛋白(24 μg/mL)进行诱抗处理后,接种培养1周的F.sulphureum菌饼(直径3 mm),分别取处理后第0、0.5、1、2、3、4 d组织,用无菌不锈钢刀切取切片表层0～3 mm处的马铃薯组织3 g,用锡箔纸包好后立即用液氮进行冷冻,然后保存于-80 ℃超低温冰箱中待测。

1.2.5 活性氧代谢相关酶活性和产物含量的测定

1.2.5.1 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的测定 a.粗酶液的提取:参照Lacan[11]的方法并修改。取3.0 g样品组织,加入3 mL 100 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,含5 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)和2% PVPP(W/V)),冰浴条件下研磨成匀浆后于4 ℃、12000×g离心30 min,上清液立即用于酶活性测定。

b.SOD的活性测定:参照Wang等[12]的方法并修改。酶活性以每毫克蛋白抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原的50%为一个酶活性单位(U/mg protein)表示。

c.CAT的活性测定:参照Beers等[13]的方法并修改。在240 nm处测定2 min内样品的吸光值,以每分钟反应体系吸光度值减少0.01所需的酶量为一个酶活性单位(U),表示为U/(mg protein)。

1.2.5.2 过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性的测定 a.POD活性测定:参照Venisse等[14]的方法并修改。POD反应体系为3 mL 0.025 mol/L愈创木酚、0.2 mL 0.25 mol/L H2O2和0.05 mL粗酶液。该酶活性以每分钟反应体系在波长470 nm处吸光度值读数变化增加1所需的酶量为1个活性单位(U),表示为U/(mg protein)。重复测定3次。

b.PPO活性测定:参照Chen等[15]的方法并做修改。PPO反应体系包括2 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸缓冲液、0.5 mL 0.05 mol/L邻苯二酚和0.2 mL粗酶液。加酶液后1 min于420 nm处开始记录反应体系每分钟的吸光值变化,连续测定2 min,以每分钟吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位,表示为U/(mg protein)。样品重复测3次。

表1 引物设计表Table 1 Primer design

1.2.5.3 H2O2含量的测定参照Prochazkova等[16]的方法并修改。取3.0 g样品组织,加入5 mL冷丙酮,冰浴磨成匀浆后于4 ℃下12000×g离心20 min。取1 mL上清液,加入100 μL 20%的四氯化钛溶液(溶于浓盐酸,V/V)和200 μL浓氨水,混匀反应5 min后离心15 min。沉淀部分用冷丙酮洗涤4次以减少色素的干扰,最后将沉淀溶于2.5 mL 2 mol/L H2SO4溶液中,于410 nm测定溶液的吸光度值。按同法作H2O2标准曲线。H2O2含量以μmol/g FW表示。

1.2.6 病程相关蛋白的测定

1.2.6.1 几丁质酶活性的测定粗酶液的提取以及活性测定参照张衍荣等[18]的方法进行。以每秒钟每克样品(鲜重)中酶分解胶状几丁质产生1×10-9mol N-乙酰葡糖胺为一个几丁质酶活性单位,单位是1×10-9mol/s·g FW。

1.2.6.2β-1,3葡聚糖酶活性的测定参照Wirth等[19]的方法。以昆布多糖为底物,以每秒钟每个样品中酶分解昆布多糖产生10-9mol葡萄糖为1个酶活性单位(U)。

1.2.7 寡雄蛋白处理后相关基因表达取寡雄蛋白诱抗处理后的马铃薯组织,液氮速冻后-80 ℃超低温冰箱中保存。采用TRIZOL法对其进行RNA的提取。

根据NCBI查得马铃薯的基因序列(表1),进而设计特异性引物,选择内参基因18 s(GenBank ID:AB971541.1)用于Real-time PCR。这部分实验在生工生物工程(上海)有限公司进行,通过柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒,按照标准抽提步骤进行基因蛋白的分离纯化,并进行测定。PCR反应条件设定为:95 ℃变性3 min;95 ℃变性15 s;60 ℃延伸40 s;记录荧光强度,40个循环。对于比较Ct值的相对定量,则根据目的基因的Ct值,按照2-ΔΔCtQ的分析方法,对于目的基因的表达谱进行分析。

1.3 数据分析

用SPSS 17.0软件对实验数据进行Duncan’s多重显著分析和Microsoft Excel 2010对实验数据进行分析并绘制图表,图中竖线代表标准误。

2 结果与分析

2.1 寡雄蛋白对马铃薯块茎抗干腐病的诱导

用不同浓度的寡雄蛋白处理马铃薯块茎后再进行损伤接种,发现其能不同程度地抑制病斑的扩展。在6～24 μg/mL范围内,随着蛋白浓度的减小,病斑的扩展增加。其中最佳诱抗浓度为24 μg/mL,在块茎培养9 d时,最佳诱抗浓度处理的病斑直径为对照组的58.3%(图1)。

图1 寡雄蛋白对马铃薯块茎的诱抗作用Fig.1 Resistance effect of oligandrin treatment on potato tuber

2.2 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎活性氧代谢的影响

图2 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎H2O2含量(A)和产生速率(B)的影响Fig.2 Effect of oligandrin treatment on the H2O2

图3 寡雄蛋白处理对马铃薯POD(A)、PPO(B)、SOD(C)和CAT(D)基因表达的影响Fig.3 Effect of oligandrin treatment on expression of POD(A),PPO(B),SOD(C)and CAT(D)genes

2.2.2 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎POD、PPO、SOD和CAT基因表达的影响与对照组相比,寡雄蛋白处理诱导了马铃薯块茎POD和PPO基因表达量的升高,POD基因表达量在2 d达到最大值,是对照组的1.46倍(图3A),且PPO基因表达量在2 d和4 d时达到高峰,分别较对照高出4.14倍和1.99倍(图3B),而对照组PPO基因表达量在整个贮藏期间没有明显变化。同时寡雄蛋白处理还可明显诱导SOD和CAT基因表达量的升高,在贮藏0.5 d时,SOD和CAT基因表达量达到最大值,分别为同期对照的1.42和1.67倍,在随后的贮藏过程中呈现逐渐下降的趋势,贮藏后期处理组和对照组没有显著性差异(图3C,图3D)。

2.2.3 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎POD、PPO、SOD、CAT活性的影响马铃薯块茎组织POD活性在整个贮藏过程中呈现持续升高的趋势,且处理组POD活性显著高于对照,在第4 d达到最大值,比对照高21.5%(图4A)。从图4B中可以看出,对照组PPO活性呈现出缓慢升高的趋势,经过蛋白诱抗处理后,马铃薯组织中PPO的活性较对照组有所升高,并且在第4 d时大幅增大,比对照组高33.9%。经过诱抗处理后的马铃薯块茎SOD活性较对照有所升高,在贮藏1～3 d的过程中,处理组SOD活性略高于对照组,且在第3 d时达到最大值,比对照高19.47%(图4C)。块茎贮藏期间CAT活性呈现出先上升后下降的趋势,寡雄蛋白诱抗处理能使块茎CAT活性上升,且在第2 d达到最大值,比对照高66.57%;而对照组CAT活性在第3 d出现最高峰(图4D)。

2.3 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎主要病程相关蛋白产生的影响

图4 寡雄蛋白处理对马铃薯POD(A)、PPO(B)、SOD(C)和CAT(D)活性的影响Fig.4 Effect of oligandrin treatment on the POD activity(A),PPO activity(B),SOD activity(C)and CAT activity(D)of potato

2.3.1 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶基因表达的影响贮藏期间块茎组织β-1,3葡聚糖酶的基因表达量表现出缓慢上升的趋势,在第4 d时对照组和处理组表达量都达到最大值,寡雄蛋白对β-1,3葡聚糖酶基因表达量的诱导与对照组无显著性差异(图5A)。在整个贮藏过程中,对照组和处理组几丁质酶基因表达量总体呈现先上升后下降,随后又上升的趋势,在贮藏2～4 d的过程中寡雄蛋白处理诱导了马铃薯块茎中几丁质酶基因表达量的升高,并且表达量在4 d达到最大值,比对照高出23.08%(图5B)。

图5 寡雄蛋白处理对马铃薯β-1,3葡聚糖酶(A)和几丁质酶(B)基因表达的影响Fig.5 Effect of oligandrin treatment on expression of β-1,3-glueanase(A)and chitinase(B)genes of potato tissue

2.3.2 寡雄蛋白处理对马铃薯块茎β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶活性的影响在贮藏前期,β-1,3葡聚糖酶活性呈现逐渐下降的趋势,在第3 d时有所上升,随后又呈下降的趋势。在整个过程中,寡雄蛋白处理的马铃薯块茎β-1,3葡聚糖酶活性低于对照组(图6A)。随着贮藏时间延长,寡雄蛋白诱抗处理显著提高了块茎组织几丁质酶活性,在贮藏0.5 d和3 d时出现峰值,分别较对照组高出46.32%和50.25%,而对照组几丁质酶活性在整个过程中变化不大(图6B)。

图6 寡雄蛋白处理对马铃薯β-1,3葡聚糖酶(A)和几丁质酶(B)活性的影响Fig.6 Effect of oligandrin treatment on the β-1,3-glueanase activity(A)and chitinase activity(B)of potato tissue

3 讨论

4 结论

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Induction of active oxygen metabolism and pathogenesis-relatedproteins in potato tubers by oligandrin treatment

YANG Lan,PAN Jing-yu,LI Yong-cai*,LIU Xiao,GAO Chun-li,BI Yang

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)