孔雀石绿及隐色孔雀石绿在花鲈组织中的分布与消除规律

丁军伟,邓建朝,杨贤庆,*,李来好,赵庆志,吴燕燕,陈胜军,李春生

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

孔雀石绿及隐色孔雀石绿在花鲈组织中的分布与消除规律

丁军伟1,2,邓建朝1,杨贤庆1,*,李来好1,赵庆志1,2,吴燕燕1,陈胜军1,李春生1

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

本实验用浓度为0.15 mg/mL的孔雀石绿药浴花鲈1 h后转移至水泥池中用淡水养殖,研究孔雀石绿(MG)及其代谢产物隐色孔雀石绿(LMG)在花鲈各组织中的分布与消除规律。采用超高效液相色谱串联质谱法快速检测MG、LMG在花鲈的背肌、鱼皮、肝脏的含量,并用内标法来进行定量。结果表明,在消除期间,LMG的浓度始终高于MG的。MG、LMG在肝脏中的浓度最高。MG在花鲈3种组织中的最大浓度由高到低的顺序为:肝脏(94.86±8.12) μg/kg>鱼皮(19.35±1.88) μg/kg>背肌(7.47±0.45) μg/kg。MG在背肌、鱼皮、肝脏中分别于168、960、2160 h时检测不到。MG在3种组织中的半衰期长短的先后顺序为:肝脏(7.22 d)=鱼皮(7.22 d)>背肌(1.44 d)。LMG在花鲈3种组织中的最大浓度由高到低的顺序为:肝脏(3607.13±189.56) μg/kg>背肌(103.65±14.97) μg/kg>鱼皮(82.10±7.64) μg/kg。LMG在3种组织中的半衰期长短的先后顺序为:背肌(28.88 d)=鱼皮(28.88 d)>肝脏(14.44 d)。消除2544 h后,背肌、鱼皮、肝脏中的LMG含量仍然高于检测限。

残留,孔雀石绿,隐色孔雀石绿,花鲈,组织分布

孔雀石绿(malachite green,MG)是水产养殖中禁用的一种三苯基甲烷类工业燃料[1-2],能有效地的防治外部真菌、原虫感染等疾病[3]。孔雀石绿多用于水产动物的繁殖、消毒和运输等环节[4]。但是MG和他的主要代谢产物隐色孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)对人体具有致畸、致癌、致突变的“三致”作用[5-6]。现在MG禁止用于所有动物食品中,但是由于孔雀石绿抗菌效果好、价格低廉,在水产养殖中仍有违规使用的情况,例如2015年5～6月,国家食品药品监督管理总局抽查水产品中发现鲈鱼等体内MG超标。2015年上海市食药监局第二季度食品安全监督抽检中发现桂鱼和黑鱼体内MG超标,2016年1月广东省食药监局对全省大型餐饮服务单位销售的水产品进行抽检发现桂鱼、黄骨鱼、鲫鱼等MG、LMG超标。这种违法使用禁止兽药的情况导致社会不安等。

表1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氚代孔雀石绿、氚代隐色孔雀石绿质谱条件Table 1 MS parameters of MG,MG-D5,LMG,LMG-D5

注:*代表定量离子。

目前,MG在水产动物体内残留消除规律的研究主要集中在鲫鱼(Carassiusauratus)[7]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[8]、鳗鲡(A.anguilla)[9]、草鱼(Ctenopha-ryngodonidellus)[10]、罗非鱼(Oreochromisspp.)[11-12]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[13]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[14]、鲤(CyprinuscarpioLinnaeus)[14]、石斑鱼(Epinephelusawoara)[15]、南美白对虾(Litopenaeusvannamei)[16-17]、斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)[4]、杂交鳢(斑鳢Channamaculata♀×乌鳢Channaargus♂)[18]、鳜(Sinipercachuatsi)[19-20]等品种,但是在淡水养殖条件下,孔雀石绿在鲈鱼(Lateolabraxmaculatus)体内的消除情况尚未报道。由于人民生活水平的提高,肉质鲜美的花鲈需要量正在增加。但是南方沿海网箱养殖的花鲈不仅种质退化和抗病力降低[21],而且在盐度为30左右时,生长缓慢,运输花鲈到内地销售费用比较高,所以内陆多地正在进行淡水化养殖花鲈。因此,研究了MG和LMG在淡水花鲈体内的组织分布和代谢规律,为加强该药物的监管及其风险评估提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花鲈 平均体重(100.0±20.0) g,购买于珠海市斗门镇某养殖场,饲养于中国水产科学院南海水产研究所深圳实验基地的室内水泥池中;甲酸、乙腈、乙酸铵 为色谱纯,美国Thermo Fisher公司;实验用水 MiliQ超纯水;标准品孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氚代孔雀石绿(MG-D5)、氚代隐色孔雀石绿(LMG-D5) 均购自美国Sigma-Aldrich公司,其他试剂为分析纯。

超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司;TDZ5-WS离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;超纯水器 美国Millipore;研磨仪 上海万柏生物科技有限公司;TKA T25匀浆机 德国;固相萃取装置 美国Supelco公司;CNW poly-Sery MCX混合型阳离子交换SPE小柱(60 mg/3 mL)。

1.2 实验方法

1.2.1 养殖条件 养殖池(2.5 m×2.5 m×1.5 m)的水深控制在1.2 m。实验前暂养一周[22],养殖用水是深圳实验基地附近的的山泉水,并且用微流水来养殖。实验期间(2015年08月至2016年01月),淡水温度的范围是17.5～25.8 ℃,正常充气并每天2次投喂空白配合饲料。

1.2.2 色谱条件 进样量:5.0 μL,柱温:40 ℃,色谱柱:ACQUITY UPLC®BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色谱柱,流速:0.3 mL/min。梯度洗脱条件:A相为5 mmol/L乙酸铵+0.1%的甲酸(色谱纯),B相为乙腈;0～0.5 min,10% B;0.5～1.5 min,10% B～90% B;1.5～2.5 min,90% B;2.5～3.0 min,90% B～10% B;3.0～5.0 min,10% B。

1.2.3 质谱条件 离子源:电喷雾电离正离子(ESI+)模式扫描;检测方式:多反应监测(MRM)模式。母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量见表1。

1.2.4 样品采集 将花鲈置于含有0.15 mg/L的孔雀石绿溶液的塑料箱中药浴1 h,然后放入不含孔雀石绿的水泥池中养殖,从放入不含药的水泥池后即为0 h,每一时间点(0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、120、168、264、456、720、960、1200、2160、2544 h)取背部肌肉、鱼皮、肝脏置于-20 ℃冰箱中保存,直至样品处理。实验组分为三个平行的给药组和一个空白对照组。

1.2.5 样品预处理 样品自然解冻后称取2.0 g放入50 mL塑料离心管中,加入2 g酸性氧化铝、15 mL的乙腈、100 μL 100 ng/mL混合内标即为氚代孔雀石绿、氚代隐色孔雀石绿溶液,通过1800 r/min、60 Hz研磨,4500 r/min离心10 min,将上清液移至50 mL的离心管中。向离心管中再加入15 mL乙腈,再研磨、离心,将上清液移至同一离心管中。用乙腈调溶液体积为35 mL,向提取液中加入3%的甲酸,振荡、离心。先活化MCX柱[23],用5 mL提取液上样,然后淋洗,最后用5%的氨水乙腈洗脱[24],洗脱液用氮气吹干,溶解残渣,过滤膜,上机检测。

1.2.6 标准曲线的制备与回收率的测定 标准曲线的制备:MG和LMG的浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL;绘制标准曲线,得到回归方程和R2。通过添加MG、LMG标准液使不含MG、LMG的花鲈各组织(背肌、鱼皮、肝脏)的含量为0.5、1、2.5 μg/kg,然后按照1.2.5预处理的方法求出含量。

1.2.7 数据处理 实验所得数据采用Microsoft Excel 2010处理,绘制药-时曲线,求出消除速率常数(β)和消除曲线方程,计算消除半衰期(t1/2)。

表3 MG、LMG在鲈鱼各组织中的消除方程与消除参数Table 3 The equations of elimination curves and parameters of MG,LMG in tissues of perch

注:β为最终消除速率常数,t1/2为消除半衰期。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线

经测定,0.5～100 ng/mL范围内MG、LMG线性良好。MG、LMG的线性方程分别为Y=1.78253X-1.63327,Y=0.41771X-8.09518,相关系数均大于0.9995。

2.2 方法回收率和精密度

取鲈鱼各组织,分别添加3个浓度水平(见表2),每个浓度水平做5个重复。各组织的平均加标回收率为95.3%～107.8%,相对标准偏差2.6%～7.3%。

表2 MG、LMG在鲈鱼各组织中的回收率(n=5)Table 2 Recovery of MG and LMG in perch tissues(n=5)

2.3 分布与消除规律

MG、LMG在鱼肉中残留量是最引起人们关注的,因为鱼肉是最主要的可食部分,也是最重要的监控组织。从表4中可以看出,MG在背部肌肉中1 h时达到最大浓度即(7.47±0.45) μg/kg,LMG在背肌中0 h时就达到最大浓度即(103.65±14.97) μg/kg。MG的半衰期为1.44 d,LMG的半衰期为28.88 d(见表3)。鱼皮是鱼与外界接触面最大的组织,鱼皮能起到保护鱼体,但是外界物质能通过渗透作用进入鱼体。从表4中可以看出,MG在鱼皮中0 h时达到最大浓度即(19.35±1.88) μg/kg,LMG在8 h时达到最大含量为(82.10±7.64) μg/kg。MG的半衰期为7.22 d,LMG的半衰期为28.88 d。肝脏在各个器官中是最主要的体内药物积累和消除器官。从表4中可以看出,MG在肝脏中8 h时达到最大浓度即(94.86±8.12)μg/kg,LMG在肝脏中1 h时达到最大浓度即(3607.13±189.56) μg/kg,在各个组织中含量是最高的。MG的半衰期为7.22 d,LMG的半衰期为14.44 d。

由表4可知,在实验过程中,MG、LMG在代谢消除过程中变化规律是不同的。MG在花鲈中浓度最高的组织是肝脏,含量高低的顺序为肝脏>鱼皮>背肌。LMG在花鲈中浓度高低的顺序为肝脏>背肌>鱼皮。肝脏中MG的含量是背肌的12.7倍,是鱼皮的4.9倍。肝脏中LMG的最高含量是背肌的34.8倍,是鱼皮的43.9倍。肝脏中MG、LMG浓度最高的原因:MG在体内的其中一种代谢途径是它在细胞色素P450催化下生成初级和次级代谢产物[9],而肝脏作为排泄组织,含有很多这种P450的混合功能的氧化酶系统[25],因此肝脏不仅可以大量富集MG,而且可以把MG大量转化为LMG。这说明鲈鱼的肝脏在积累和消除MG过程中起着重要作用。

MG在鲈鱼的组织中能快速转化为LMG。在消除期间,LMG在鲈鱼组织的含量始终高于MG。在0 h时,背肌中的LMG含量是MG的17.2倍,鱼皮中的LMG含量是MG的3.6倍,肝脏中的LMG含量是孔雀石绿的44.5倍。谭志军[26]等在海水养殖中用1.0 mg/L的MG连续浸泡花鲈6次,1次/d,2 h/次,结果表明,LMG在各组织中的含量高于MG的含量。这说明经不同药浴浓度和药浴时间,MG在鲈鱼的组织中能快速转化为LMG的能力的差异不显著。杨贤庆[12]等用2 mg/L的MG浸泡1 h大规格的淡水罗非鱼,在0 h时,LMG在肌肉中的含量低于MG,其他组织中的LMG在肌肉中的含量低于MG含量的2倍。李爱心[10]等用0.3 mg/L的MG药浴1 h草鱼,在1～12 h时,LMG在肌肉、血液中的含量低于MG。邱绪建[7]等用0.2 mg/L的MG药浴1 h鲫鱼,在1～12 h时,LMG在肌肉、血液中的含量低于MG。刘永涛[4]等用7 mg/L的MG药浴5 min斑点叉尾鮰,在0.25 h时,LMG在血液中的含量低于MG,在0.25 h时,LMG在肌肉、皮肤中的含量低于MG的含量的2倍。刘书贵[20]等用1 mg/L的MG药浴1 min鳜鱼,在0 h时,LMG在肌肉、血液中的含量低于MG。万译文[19]等用5 mg/L的MG药浴2 h鳜鱼,在0.5 h,LMG在鳃中的含量低于MG,LMG在腹肌、皮肤中的含量低于MG的含量的2倍,LMG在背肌中的含量低于MG的含量的9倍。曲志娜[8]等用0.8 mg/L的MG药浴1 h大菱鲆,在0 h时,LMG在肌肉中的含量低于MG的含量的4倍。陈培基[16]等用0.2 mg/L的MG药浴2 h和0.40 mg/L的MG药浴2.5 h南美白对虾,在0 h时,LMG在虾肉中的含量低于MG的含量的4倍。黄金田[13]等用2 mg/L的MG药浴1 h中华绒螯蟹,在0 d时,LMG在蟹肉中的含量低于MG的含量的2倍。这可以说明,在已报道过的MG在水产品的消除过程中,MG在鲈鱼的组织中转化为LMG的能力是最强的。

表4 0.15 mg/L孔雀石绿药浴鲈鱼1 h后MG、LMG在各组织中的浓度Table 4 The concentration of MG and LMG in organizations of perch dipped in 0.15 mg/L MG for 1 h

注:ND代表低于检测限。

盐度也对水产的药物代谢动力学有影响。通过比较花鲈在淡水养殖中MG的代谢规律与谭志军[26]等在海水养殖中MG的代谢规律发现:MG、LMG在淡水鲈鱼的肝脏、背肌的消除速率大部分慢于海水花鲈。Ishida[27]在对淡水虹鳟和海水虹鳟口服恶喹酸的实验得出,24 h后恶喹酸在淡水虹鳟组织中的代谢速度慢于海水虹鳟。这两者基本相似。

3 结论

采用超高效液相色谱串联质谱法快速检测MG、LMG在花鲈的背肌、鱼皮、肝脏的含量,并用内标法来进行定量。结果表明,在消除期间,LMG的浓度始终高于MG。MG、LMG在肝脏中的浓度最高。MG在肝脏、鱼皮、背肌中达到最高浓度的时间分别为8、0、1 h。MG在背肌、鱼皮、肝脏中分别于168、960、2160 h时检测不到。MG在3种组织中的半衰期的先后顺序为肝脏=鱼皮>背肌。LMG在花鲈3种组织中的浓度由高到低的顺序为:肝脏>背肌>鱼皮。LMG在肝脏、鱼皮、背肌中达到最高浓度的时间分别为1、8、0 h。LMG在3种组织中的半衰期长短的先后顺序为背肌=鱼皮>肝脏。消除2544 h后,背肌、鱼皮、肝脏中的LMG含量仍然高于检测限。从实验结果发现,取样的时间最好包括0、1、8 h;重点检测的部位为鱼肉、鱼皮。

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Tissue distribution and elimination of malachite green and leucomalachite green in perch(Lateolabraxmaculatus)

DING Jun-wei1,2,DENG Jian-chao1,YANG Xian-qing1，*,LI Lai-hao1,ZHAO Qing-zhi1,2,WU Yan-yan1,CHEN Sheng-jun1,LI Chun-sheng1

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Lab of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China;2.Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

The distribution and depletion rules of MG and its metabolite LMG in organizations of perch were investigated,that were dipped in the concentration of 0.15 mg/mL MG for 1 h,and that reared in tanks containing(0)indoor. Skin,back muscle and liver of perch were analyzed by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry carrying out qualitative and quantitative analysis of target analytes. The concentration of LMG was much higher than that of MG during the experiment. The concentration of MG and LMG in liver was highest. The result of MG concentrations in back muscle,skin,liver of perch showed that the order of 3 kinds of tissues concentration levels of MG from high to low were respectively liver(94.86±8.12) μg/kg,skin(19.35±1.88) μg/kg,back muscle(7.47±0.45) μg/kg. MG was not detected in back muscle,skin,liver of perch at 168 h,960 h,2160 h. The order of 3 kinds of tissues half-time of MG from long to short were respectively liver(7.22 d),skin(7.22 d),back muscle(1.44 d). The order of 3 kinds of tissues concentration levels of LMG from high to low were respectively liver(3607.13±189.56) μg/kg,back muscle(103.65±14.97) μg/kg,skin(82.10±7.64) μg/kg. The order of 3 kinds of tissues half-time of LMG from short to long were respectively liver(14.44 d),skin(28.88 d),back muscle(28.88 d). Even after 2544 h of elimination,LMG in back muscle,skin,liver even could be detected.

residues;malachite green;leucomalachite green;perch;tissue distribution

2016-08-09

丁军伟(1986-)，男，硕士研究生，研究方向：水产品加工与质量安全，E-mail:ShouDingJW@163.com。

*通讯作者:杨贤庆(1963-)，男，本科，研究员，研究方向：水产品加工与质量安全，E-mail：yxqgd@163.com。

国家科技支撑项目(2015BAD17B03-1，2015BAK36B06)；国家农产品质量安全风险评估项目(GJFP201501201)；广东省海洋渔业科技与产业发展专项(A201501C02)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2015YD02)。

TS254.4

A

:1002-0306(2017)04-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.017