青蒿琥酯对耐地塞米松的多发性骨髓瘤细胞株增殖及NF-κB p65、P-gp表达影响

欧瑞明，周长华，谭友平，刘爽，钟启，张青，杜苑苑，郑丽玲(广东省第二人民医院，广州 510317)

青蒿琥酯对耐地塞米松的多发性骨髓瘤细胞株增殖及NF-κB p65、P-gp表达影响

欧瑞明，周长华，谭友平，刘爽，钟启，张青，杜苑苑，郑丽玲
(广东省第二人民医院，广州 510317)

目的 探讨青蒿琥酯对耐地塞米松人多发性骨髓瘤(MM)细胞株MM.1R增殖的影响，并探讨其可能作用机制。方法 取对数生长期MM.1S、对塞米松敏感的MM细胞株MM.1R，各分为空白对照组、地塞米松组、青蒿琥酯组、地塞米松+青蒿琥酯组，分别加入等量培养液、20 ng/mL的地塞米松、25μg/mL的青蒿琥酯、20 ng/mL的地塞米松+25μg/mL的青蒿琥酯，观测各组细胞增殖情况，计算细胞增殖抑制率。取MM.1R细胞加入终浓度为25μg/mL的青蒿琥酯，分别于给药前、给药24 h、给药48 h检测细胞核转录因子κB (NF-κB) p65蛋白、P糖蛋白(P-gp)蛋白的表达。结果 给药24 h时，MM.1S细胞地塞米松组、青蒿琥酯组、地塞米松+青蒿琥酯组的细胞增殖抑制率分别为20.41%±2.75%、29.07%±2.71%、68.92%±4.12%，组间两两比较，P均<0.05；给药24 h，MM.1R细胞地塞米松组、青蒿琥酯组、地塞米松+青蒿琥酯组的细胞增殖抑制率分别对为4.13%±3.10%、27.43%±2.67%、60.14±3.24%，组间两两比较，P均<0.05；青蒿琥酯给药前、给药24 h、给药48 h， MM.1R细胞NF-κB p65蛋白的相对表达量分别为0.89±0.21、0.42±0.13、0.23±0.08；P-gp蛋白的相对表达量分别为0.86±0.19、0.43±0.13、0.25±0.09，随干预时间增加，MM.1R细胞NF-κB p65、P-gp蛋白的相对表达量均降低(P均<0.05)。结论 青蒿琥酯可抑制MM.1S以及MM.1R细胞的增殖，与地塞米松联用有协同效应。青蒿琥酯抑制MM.1R细胞增殖的机制可能为下调NF-κB p65、P-gp蛋白的表达。

青蒿琥酯；多发性骨髓瘤；细胞增殖；核转录因子κB p65蛋白；P糖蛋白

多发性骨髓瘤(MM)约占血液系恶性肿瘤10%，近年发病率逐年上升。化疗、造血干细胞移植是MM的主要治疗方法，地塞米松是常用的MM化疗药物。硼替佐米、来那度胺等新药及大剂量化疗药物联合自体造血干细胞移植是新兴的MM治疗方法，大大提高了MM患者的病情缓解率及患者生存期。但MM细胞易产生耐药性，多数患者治疗后容易发生MM复发(或难治)[1]。发掘能克服MM耐药的新药物或治疗新方案，提高复发(或难治)MM的疗效是目前的研究热点。青蒿琥酯是我国传统抗疟中药,最新研究发现其具有广泛的抗肿瘤活性，对肝癌、结肠癌、乳腺癌等实体瘤以及白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液系统肿瘤细胞均有一定的增殖抑制作用，并具与传统抗肿瘤药物无交叉耐药，且能逆转肿瘤细胞多药耐药的优点[2，3]。目前关于青蒿琥酯对地塞米松耐药的人MM细胞株抗肿瘤作用的相关报道较少。本研究探讨了青蒿琥酯对地塞米松耐药(MM.1R)、地塞米松敏感(MM.1S)的人MM细胞株细胞增殖的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料及试剂 地塞米松耐药(MM.1R)、地塞米松敏感(MM.1S)性人多发性骨髓瘤细胞株来源于ATCC细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，3～4天换液传代1次。核转录因子κB (NF-κB)p65蛋白、P糖蛋白(P-gp)、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；注射用青蒿琥酯为桂林南药股份有限公司生产(批号H10930195)。

1.2 青蒿琥酯对MM.1S、MM.1R细胞增殖的影响观察 分别取对数生长期MM.1S、MM.1R细胞，胰酶消化，调整细胞悬浮液浓度为5×104/mL，100 μL/孔接种于96孔板，孵育24 h，将MM.1S、MM.1R细胞各分为对照组和观察组(地塞米松组、青蒿琥酯组、地塞米松+青蒿琥酯组)，分别加入等量培养液、终浓度20 ng/mL的地塞米松、终浓度25 μg/mL的青蒿琥酯、终浓度20 ng/mL的地塞米松+终浓度25 μg/mL的青蒿琥酯，每组3个复孔，终体积为200 μL。采用MTT法检测各组细胞增殖抑制情况。所有操作均严格按照使用说明书进行。采用酶标仪检测570 nm波长处的吸光度值(A570)，重复3次，取平均值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-A观察组/A对照组)×100%。

1.3 青蒿琥酯对MM.1R细胞p65、P-gp蛋白表达的影响 取对数生长期MM.1R细胞，分别于给药前、给药24 h、给药48 h采用Western blotting法检测细胞NF-κB p65、P-gp蛋白的表达。取各组细胞, 冰上裂解细胞，采用BCA法提取总蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗(NF-κB p65、P-gp、GAPDH抗体)4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，ECL显色，胶片曝光，扫描成像。采用Gelpro软件测量目的条带的灰度值，以GAPDH作为内参，以目的蛋白与GAPDH灰度值之比作为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 各组细胞增殖抑制率比较见表1、2。

表1 MM.1R细胞增殖抑制率比较(%，±s)

注：与地塞米松组比较，*P<0.05；与青蒿琥酯组比较，#P<0.05。

表2 MM.1S细胞增殖抑制率比较(%，±s)

注：与地塞米松组比较，*P<0.05；与青蒿琥酯组比较，#P<0.05。

2.2 不同给药时间MM.1R细胞 p65、P-gp蛋白相对表达量比较 给药前、给药24 h、给药48 h，MM.1R细胞p65蛋白的相对表达量分别为0.89±0.21、0.42±0.13、0.23±0.08。给药前、给药24 h、给药48 h，MM.1R细胞P-gp蛋白的相对表达量分别为0.86±0.19、0.43±0.13、0.25±0.09。随干预时间增加，MM1.R细胞NF-κB p65、P-gp蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。

3 讨论

MM细胞容易发生耐药。虽然来那度胺、硼替佐米等新药与传统化疗药物的联合使用对克服MM耐药有一定成效，但也面临毒性作用加大、治疗费用增加等诸多问题。研究表明，青蒿琥酯能够抑制MM细胞的增殖并诱导其凋亡，不但对正常组织细胞的毒性很低，而且与传统化疗药物无交叉耐药，能增加MM细胞对化疗药物的敏感性，逆转MM细胞多药耐药性[4]。地塞米松作为经典的抗MM治疗药物，即使在目前MM治疗的新药时代，仍是各种MM治疗方案中的基础用药之一。本实验中选取的MM.1细胞株建株于一IgA型MM患者的外周血，其亚系糖皮质激素敏感的细胞系MM.1S和耐药的细胞系MM.1R均来源于这一母系，分别代表了MM进展的不同阶段，是研究MM疾病进展和耐药的理想模型[5]。

青蒿琥酯作为我国拥有完全自主知识产权的传统中药衍生物，具有低毒、价廉的优点，是一种理想的抗肿瘤药物增敏剂，与常规抗骨髓瘤药物联合使用有可能进一步提高耐药MM的疗效。既往的研究显示，青蒿琥酯能通过介导MM细胞G0/G1期阻滞、抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡、抑制MM血管新生、逆转MM细胞多药耐药等多种机制，抑制多发性骨髓瘤的发生、发展[4]。本研究结果显示，青蒿琥酯对MM.1R具有增殖抑制作用，能降低其NF-κB p65及P-gp的表达，并且其抑制率与MM.1S相近，提示其抗肿瘤效应与地塞米松不存在交叉耐药，而青蒿琥酯与地塞米松联合用药，抑制率较单药明显升高，提示两药联合有良好的协同效应，能克服MM细胞的耐药性。MM细胞的耐药机制较为复杂，且耐药多表现为多耐药反应(MDR)，目前认为主要与多药耐药基因(MDR1)的过度表达、凋亡调控基因介导机制等有关，其中最主要的耐药机制是NF-κB通路的活化，使得受NF-κB调控的下游基因如MDR1、Bcl-2表达增加[6]。研究表明，NF-κB通过调节细胞周期促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进血管新生等多种机制在MM的发生、发展中起关键作用，并与MM细胞多药耐药的发生密切相关[7]。细胞周期蛋白D1(CyclinD1)启动子上含有两个NF-κB结合位点，NF-κB可促进CyclinD1的表达，从而促使细胞由G0/G1期向S期转化，加速细胞周期，促进肿瘤细胞增殖。此外，NF-κB还可以通过上调其下游抗凋亡因子的水平来发挥抗凋亡作用，其中包括Bcl-2蛋白家族，细胞凋亡抑制蛋白家族、肿瘤坏死因子受体相关因子家族等。研究还发现，NF-κB活化伴随各种血管生成因子的活化，如成纤维生长因子、血管生成衍生生长因子、基质金属蛋白酶等，能促进肿瘤血管的生成。耐药的产生是导致MM治疗失败的重要原因，其中P-gp介导的多药耐药途径是肿瘤细胞最为经典的耐药机制，由MDRl编码的P-gp是一种跨膜蛋白，具有能量依赖性外排泵功能，能够降低细胞内药物浓度从而产生多药耐药。MDR1启动区域的第1个外显子包含1个纯化的NF-κB结合序列(5′-CCTYTCGGGG-3′)，MDR1作为NF-κB的下游基因，能够被NF-κB激活，使得基因转录增加，P-gp合成增加而导致耐药的发生[8～10]。研究[11]还发现，青蒿琥酯能下调MM细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，明显抑制MM细胞的增殖并诱导其凋亡。研究[12，13]发现，青蒿琥酯还能通过下调VEGF的表达水平，抑制MM细胞诱导的的血管新生。进一步研究还发现，青蒿琥酯能下调耐药蛋白P-gp的表达，逆转对阿霉素、米托蒽醌、依托泊苷和甲氨蝶呤等多药耐药的MM细胞株的耐药性[14]。

除了抑制NF-κB通路活化之外，青蒿琥酯的抗骨髓瘤作用还有多种机制参与，其中诱导自由基的产生及氧化应激方面值得关注。青蒿素类药物中都含有独特的过氧桥结构,在细胞内二价铁离子的催化作用下，青蒿素类药物中的过氧桥发生裂解，产生大量以青蒿素碳原子为中心的自由基和活性氧簇(ROS),这种独特的作用机制可能其是杀伤具有耐药性的疟疾和肿瘤细胞的作用基础[15，16]。Papanikolaou等[17]研究证实，青蒿琥酯能通过增加细胞内ROS的产生，促进线粒体膜间蛋白凋亡诱导因子及核酸内切酶G释放及核转位，诱导耐药MM细胞株发生Caspase非依赖性的凋亡，其效应与细胞内二价铁离子水平密切相关，提示青蒿琥酯通过ROS诱导的细胞凋亡亦可能是其克服MM细胞耐药的重要作用机制之一。

综上所述，青蒿琥酯可抑制MM.1S以及MM.1R细胞的增殖，下调MM.1R细胞NF-κB p65、P-gp蛋白的表达水平，抑制NF-κB活化、下调P-gp表达可能为青蒿琥酯克服MM细胞耐药的机制之一，但其具体作用靶点以及对细胞凋亡相关信号通路的影响仍有待进一步研究。

[1] 李晓武.复发难治性多发性骨髓瘤的药物治疗新进展[J].中国肿瘤临床,2012,39(3):174-178.

[2] 盛庆寿,李国桥.青蒿琥酯抗肿瘤实验研究进展[J].广州中医药大学学报,2007,24(5):438-440.

[3] 蒋红艳,姚安贵,江尚飞.青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[J].中国生化药物杂志,2014,34(6):181-183.

[4] 成志勇,杨晓阳,魏玉涛,等.青蒿琥酯抗骨髓瘤作用机制研究进展[J].癌变·畸变·突变,2010,4(3):326-328.

[5] 潘含章,杨敏,沈丹，等.雷公藤内酯醇对人多发性骨髓瘤细胞耐地塞米松细胞株的实验研究[J].中华血液学杂志,2008,29(10):691-693.

[6] Bentires-Alj M, Barbu V, Fillet M, et al. NF-kappaB transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells[J]. Oncogene, 2003,22(1):90-97.

[7] 韦中玲,汪兴洪. NF-κB在多发性骨髓瘤的研究进展[J].医学研究杂志,2007,36(11):98-101.

[8] 李世辉,潘崚,薛芳,等.青蒿琥酯对骨髓瘤细胞SP2/0的作用观察及其机制的初步探讨[J].中华肿瘤杂志,2008,30(1):16-20.

[9] Li S,Xue F,Cheng Z,et al. Effect of artesunate on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of SP2/0 myeloma cells through affecting NFκB p65[J].Int J Hematol, 2009,90(4):513-521.

[10] 李世辉,潘崚,薛芳,等.青蒿琥酯对SP2/0骨髓瘤细胞的强效增殖抑制及促凋亡作用[J].中成药,2007,29(3):434-435.

[11] Holien T, Olsen OE, Misund K, et al. Lymphoma and myeloma cells are highly sensitive to growth arrest and apoptosis induced by artesunate[J]. Eur J Haematol, 2013,91(4):339-346.

[12] Chen H, Shi L,Yang X, et al. Artesunate inhibiting angiogenesis induced by human myeloma RPMI8226 cells[J].Int J Hematol, 2010,92(4):587-597.

[13] 李世辉,潘崚,薛芳,等.青蒿琥酯抑制血管新生作用的实验研究[J]. 中成药, 2008,30(10):1532-1534.

[14] 符祥俊,姚红霞,林丽娥,等.青蒿琥酯逆转多发性骨髓瘤细胞株多药耐药的实验研究[J].安徽医科大学学报,2013,48(9):1075-1078.

[15] 母佩,张厚德,杜冀晖.活性氧在青蒿素及其衍生物抗肿瘤作用机制中的研究进展[J].当代医学,2013,19(16):13-15.

[16] 孙志明.黄花蒿中青蒿素抗癌作用研究进展[J].中国医药导刊,2010,12(11):1933-1934.

[17]Papanikolaou X,Johnson S,Garg T, et al. Artesunate overcomes drug resistance in multiple myeloma by inducing mitochondrial stress and non-caspase apoptosis[J]. Oncotarget, 2014,5(12):4118-4128.

国家自然科学基金资助项目(81400168)；广东省医学科研基金资助项目(A2013128)；广东省中医药局科研课题(20131104)；广东省第二人民医院人才引进基金项目(YY2014-002)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.010

R722.12

A

1002-266X(2017)07-0034-03

2016-09-17)