BMP4对胃癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制

马松林，张姮，廖宇圣，徐丹，吴杰

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430014)

BMP4对胃癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制

马松林，张姮，廖宇圣，徐丹，吴杰

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430014)

目的 探讨骨形态发生蛋白4(BMP4)在胃癌细胞迁移和侵袭过程中的作用及其可能机制。方法 传代培养胃癌细胞MGC-803，随机分为BMP4组、anti-BMP4组和对照组。BMP4组、anti-BMP4组分别加入基因重组BMP4、anti-BMP4抗体，对照组加入等量阴性血清。培养48 h，分别取三组细胞，检测细胞迁移能力(细胞划痕实验)、侵袭能力(Transwell小室法)，采用qRT-PCR法、Western blotting法检测Snail mRNA和蛋白表达。结果 BMP4组划痕愈合率为(80.6±7.3)%，anti-BMP4组为(43.2±2.6)%，对照组为(39.9±1.7)%；BMP4组侵袭细胞数为(83.2±5.3)个，anti-BMP4组为(49.7±3.1)个，对照组为(46.9±4.6)个；BMP4组划痕愈合率、侵袭细胞数均明显高于anti-BMP4组和对照组(P均<0.05)，而anti-BMP4组和对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。BMP4组Snail mRNA的相对表达量为4.3±0.20，anti-BMP4组为1.4±0.23，对照组为1.0±0.17；BMP4组Snail蛋白的相对表达量为5.3±0.59，anti-BMP4组为1.9±0.29，对照组为2.1±0.17；BMP4组Snail mRNA和蛋白的相对表达量均明显高于anti-BMP4组、对照组(P均<0.05)，而anti-BMP4组和对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 BMP4能促进胃癌细胞的迁移及侵袭，其机制可能与上调Snail表达有关。

胃癌；骨形态发生蛋白4；细胞迁移；细胞侵袭

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，尽管通过手术、放疗及化疗等可在一定程度上提高胃癌的治疗效果，但患者5年生存率仍低于30%，特别是转移性胃癌患者生存时间一般不足2年[1，2]。目前对胃癌转移的机制仍不完全清楚。骨形态发生蛋白4(BMP4)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，在肿瘤形成过程中具有重要作用[3]。BMP4可抑制胶质瘤干细胞活性[4]，还可诱导癌细胞发生上皮间质转化(EMT)，进而促进癌细胞恶性表型[5]。但目前关于BMP4在胃癌迁移和侵袭中的作用鲜见报道。2015年1月～2016年1月，我们观察了BMP4对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。现分析结果并探讨其可能的作用机制，以期为治疗转移性胃癌提供理论基础和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌细胞MGC-803，购自华中科技大

学同济医学院实验动物中心。TRIzol试剂，购自美国Invitrogen公司；cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、RR014A qRT-PCR Kits试剂盒，购自日本TaKaRa公司；BMP4及内参GAPDH引物，由华大基因生物科技有限公司合成；BMP4一抗、GAPDH一抗、羊抗鼠二抗，购自美国Abcam公司；基因重组BMP4、anti-BMP4抗体，购自美国Sigma公司；Transwell小室，购自美国Millipore公司。全自动Western blotting实验系统，购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养及细胞处理 取胃癌细胞MGC-803约2×104个，置于含10% FBS的DMEM中，37 ℃ 5% CO2培养箱培养48 h。待细胞生长至对数生长期时，胰酶消化后传代，将传代后细胞置于不同培养皿中，随机分为BMP4组、anti-BMP4组、对照组。BMP4组加入10 ng/mL基因重组BMP4 20 μL，anti-BMP4组加入10 ng/mL anti-BMP4抗体20 μL，对照组加入等量阴性血清，培养48 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 细胞迁移能力 采用细胞划痕实验。取三组细胞接种于6孔板，待细胞完全融合时，用200 μL移液器枪头在细胞表面作“一”字划痕。采用WimScratch在线图像分析系统测定48 h划痕愈合率。划痕愈合率=(划痕即刻面积-划痕48 h面积)/划痕即刻面积×100%。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 细胞侵袭能力 采用Transwell小室法。取三组细胞各2×104个，接种于Matirge胶包被的Transwell小室，下室为常规培养基，培养48 h，取出Transwell小室，小心擦掉上室表面细胞，甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下观察。随机取10个200倍视野，计数侵袭细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 Snail mRNA和蛋白表达 ①Snail mRNA：采用qRT-PCR法。取三组细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA。取各组细胞总RNA 1 μg，按cDNA反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。引物序列：Snail上游引物：5′-AGGTTGGAGCGGTCAGC-3′，下游引物：5′-CCTTCTCTAGGCCCTGGCT-3′；GAPDH上游引物：5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′，下游引物：5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′。反应条件：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共40个循环。以内参GAPDH进行标准化，按qRT-PCR Kits试剂盒说明书要求配制反应体系并进行PCR扩增反应。采用2-ΔΔCt法计算Snail mRNA的相对表达量。②Snail蛋白：采用Western blotting法。取三组细胞，RIPA冰上裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液，BCA法进行蛋白定量。取30 μL蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2～3 h，一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，0.5% PBST洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，0.5% PBST洗膜后，ECL发光液化学发光，凝胶成像系统显影。采用用Quantity One 1-D分析软件对蛋白印迹条带进行定量。以目的蛋白测定值与GAPDH测定值的比值作为Snail蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞迁移和侵袭能力比较 见表1。

表1 各组细胞迁移和侵袭能力比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与anti-BMP4组比较，#P<0.05。

2.2 各组Snail表达比较 见表2。

表2 各组Snail mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与anti-BMP4组比较，#P<0.05。

3 讨论

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤[6]，全国肿瘤防治研究办公室2012年的数据显示，胃癌年龄标化发病率为22.06/10万，居所有恶性肿瘤的第二位[7]。进食腌制食品、幽门螺杆菌感染等都是导致胃癌发病的重要因素。目前认为，肿瘤的发生、发展是一系列关键信号通路及分子变异的结果，如p53、p21、Ras、TGF-β信号通路、BMP4、EMT等；肿瘤转移是导致患者死亡的重要原因[8]。 研究证实，EMT是肿瘤转移起始所经历的必须步骤，其过程涉及细胞表型的改变，由上皮细胞表型转变为间质细胞表型，涉及到上皮标志物E-cadherin表达下调，间质标志物N-cadherin、Vimentin表达上调[9]。Snail是EMT过程中的关键转录调控因子，能下调E-cadherin表达、上调Vimentin表达，进而诱导EMT的发生，促进肿瘤侵袭、转移和演进[10,11]。

BMP4作为TGF-β超家族成员之一，具有广泛的生物学作用，包括促进骨与软骨的生成、调控多种细胞的增殖与分化，在胚胎发育早期以及骨的形成过程中发挥重要作用[12,13]。近年研究发现，BMP4在肿瘤形成过程中亦具有重要作用[3]。BMP4能够促进癌细胞发生EMT，在多种肿瘤中已有报道。如BMP4促进细胞卵巢癌、胰腺癌、舌鳞癌等细胞的EMT[14～17]。在肝癌中，BMP4还能诱导肝癌细胞分化[18]。BMP4主要通过与相应的细胞受体结合，进而通过TGF-β/Smads信号通路影响EMT，促进肿瘤的迁移和侵袭[19，20]。有研究发现，胃癌组织BMP4高表达，抑制BMP4能增加胃癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性[21]。但BMP4对胃癌细胞迁移和侵袭的影响目前鲜见报道。

本研究发现，BMP4组划痕愈合率明显高于anti-BMP4组和对照组，侵袭细胞数明显多于anti-BMP4组和对照组，表明上调BMP4表达能显著增强胃癌细胞的迁移及侵袭能力。BMP4组Snail mRNA和蛋白的相对表达量显著高于anti-BMP4组和对照组，表明上调BMP4表达可增加Snail表达；而Snail是调控EMT的关键分子，其表达增加可显著抑制E-cadherin表达及促进Vimentin表达[10,11，22]，促进EMT过程，进而增强胃癌细胞迁移及侵袭能力。这与其在卵巢癌[23]和胰腺癌[24]中的研究结果类似。

综上所述，BMP4能促进胃癌细胞的迁移及侵袭，其机制可能与上调Snail表达有关。阻断BMP4的表达或抑制BMP4的功能有望成为治疗转移性胃癌的重要策略。

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吴杰(E-mail： wujiezxhospital@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.011

R735.2

A

1002-266X(2017)08-0038-03

2016-03-01)