传统发酵蔬菜中微生物多样性研究进展

李锋，孙美娟

(1.黔南民族师范学院 化学化工学院，贵州 都匀 558000；2.百色学院 材料科学与工程学院，广西 百色 533000)

传统发酵蔬菜中微生物多样性研究进展

李锋1，孙美娟2

(1.黔南民族师范学院 化学化工学院，贵州 都匀 558000；2.百色学院 材料科学与工程学院，广西 百色 533000)

传统发酵蔬菜是我国蔬菜加工产品的重要产品之一，它以新鲜蔬菜为原料，通过多种微生物混合发酵而成。微生物发酵对其风味、质量有着重要影响，因此探讨研究微生物多样性对营养成分和风味物质的变化有着重要意义。回顾了国内外有关蔬菜发酵微生物多样性的研究现状并进行了综述，以期为推进传统发酵蔬菜产业的规模化发展提供技术资料。

发酵蔬菜；微生物；多样性；发酵

发酵蔬菜是由微生物混合发酵而成，它在我国非常普遍且消费量很大。其加工工艺简单、制作成本低、具有多种口味，能够满足大众口味需求。我国传统发酵蔬菜食品多种多样，如东北酸菜、涪陵榨菜、四川泡菜、独山盐酸菜、河南酸菜和扬州酱菜等[1]。现代科学研究证明发酵蔬菜食品中含有丰富的益生菌，具有一定的调节肠道菌群平衡，降低胆固醇等功能[2]。随着人们对发酵蔬菜食品营养价值的进一步重视，国内外学者开始着手从微生物多样性对食品风味、食用安全性等方面进行系统研究。本文对发酵蔬菜中微生物多样性进行了综述，以期为筛选优良菌株制作高品质发酵制剂，并推进我国传统发酵蔬菜食品规模化生产与发展提供参考资料。

1 传统发酵蔬菜

发酵蔬菜是以蔬菜为原料，经过酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物混合发酵而成风味食品，因地域不同，加工各异不同，风味也各异。它不仅保留蔬菜的营养成分如氨基酸、膳食纤维和维生素C等营养物质，而且富含益生菌等功能微生物。我国传统发酵蔬菜大多还是采用自然发酵的加工工艺，发酵周期较长，规模小，并且发酵过程中微生物区系复杂多变，产品风味不稳定定，严重制约我国发酵蔬菜产业的规模发展[3]。然而韩国、日本、美国等发达国家已经采用人工接种进行发酵蔬菜，并实现规模化生产。其中韩国和日本泡菜产业尤为迅速，尤其以韩国泡菜最为有名[4]，韩国泡菜已经发展成为纯粹的工业化产品，是韩国重要出口食品之一。

近年来食品安全问题层出不穷，其中发酵蔬菜食品营养价值和食用安全问题也逐渐被重视，许多学者开始关注微生物与发酵蔬菜风味品质及食用安全之间存在怎样微妙的关系。蔬菜发酵过程涉及多元的物理化学变化，这些变化会直接影响食品的质量与安全，微生物正式这些变化的“元凶”[5]。通过研究蔬菜发酵过程中微生物的动态变化对形成风味好，质量高的产品至关重要[6]。因此要实现发酵蔬菜从传统自然发酵到人工接种的转变，必须了解发酵过程中微生物的动态变化区系[7]。

2 国外发酵蔬菜微生物多样性研究进展

近几十年来，国外研究人员相继对发酵蔬菜中微生物区系分布、优良菌株选育、发酵条件对微生物活动及有害微生物的影响等进行了相关研究，并取得较好成果。美国Feming课题组对酸菜中微生物区系研究较早且全面[8]，研究结果表明圆白菜发酵分两个阶段(初始异型发酵和后续同型发酵)发酵过程中的主体微生物为乳酸菌，利用形态学和生理生化反应鉴定出4种乳酸菌，分别为：Leuconostocmesenteroides、Lactobacilllusbrevis、Pediococcuspentosaceus和Lact.plantaum。Vethachai等[9]从酸菜中筛选分离出686株菌，利用DNA指纹图谱技术分析表明，其发酵过程中存在更加多样化乳酸菌种类，包括柠檬明串珠菌、阿根廷明串珠菌等，同时发现一种新菌种(Leuconostocfallax)。

关于发酵蔬菜方面研究及规模化生产，不得不提国外发酵蔬菜的代表—韩国泡菜(Kimchi)，已经被列入教科文组织人类非物质文化遗产名录。韩国泡菜种类多达190种，销往全球100多个国家。韩国泡菜能够规模化发展，得益于研究者对泡菜中微生物种类及功能的全方位深入研究，从而控制产品质量，使其工业化生产。Myungjin等[10]采用16SrRNA基因克隆库方法，分析五种不同泡菜中微生物群落结构，结果发现乳酸菌占较大百分比，包括乳酸杆菌属、魏斯氏菌属和明串珠菌属，其中韩国泡菜中的一类菌种(Weissellakoreensis)在所有样品中都存在，并且这些菌种占总菌数量的42.6%-82%。Hyun-JuEom等[11]研究德国泡菜、韩国泡菜、腌黄瓜前期发酵的微生物多样性，从中分离出肠膜明串菌株，证明此菌是发酵过程中起主要作用的菌株，并还可以产葡萄糖蔗糖酶。Jung等[12，13]通过分析研究韩国泡菜菌群结构，发现异型发酵乳酸菌Leuc.Mesenteroides是其发酵过程的优势功能菌，其可以改善产品风味。目前韩国很多泡菜企业已将其作为接种剂用于工业化生产。综上所述可见通过研究发酵蔬菜微生物区系进行全面系统研究，可以促进泡菜行业的产业化发展。

3 国内发酵蔬菜微生物多样性研究进展

我国发酵蔬菜种类繁多，如东北酸菜、四川泡菜、凯里酸汤、扬州酱菜等，但对其微生物多样性研究相对起步较晚。为了弘扬我国发酵蔬菜的特色及其产业化生产，国内科研院所也已经开始探索其中微生物多样及其动态变化的发酵机理，并取得一定进展。

发酵蔬菜中微生物多样性起初大多采用传统培养的方法进行筛选分离、鉴定。如：谈重芳[14]等从河南林州泡菜中分离出15株乳酸菌，其中13株属于乳杆菌属的6个种，分别为：粒形乳杆菌、戊糖乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌和短乳杆菌；另两株为肠膜明串珠菌。张蓓蓓等[15]以四川地区泡菜为主要分离源，从四川地区20多个市县的180余份泡菜样品中，分离到447株菌种，分属于11个属34个种。并首次确定了植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌等3个属，17个种乳酸菌为主要优势菌群。武俊瑞等[16]通过选择性培养和形态学观察，分别从5份不同产地传统发酵酸菜汁中，分离纯化筛选出4株耐酸性的乳酸菌，经16S rDNA序列分析鉴定分别为清酒乳杆菌和植物乳杆菌；由此可见自然发酵酸菜中可作为潜在益生乳酸菌分离筛选的资源库。李欣等[17]采自大庆地区的传统酸菜发酵液中分离得到14株菌株，经16S rDNA序列分析分别为：4株弯曲乳杆菌、3株清酒乳杆菌、5株植物乳杆菌、1株短乳杆菌和1株肠膜明串珠菌，其中6株菌株在pH为3.0的酸性条件下具有较强生存能力。Chao等[18]对台湾客家部落传统酸菜和福菜的五个不同发酵阶段进行微生物多样性，共筛选到119种乳酸菌，这些细菌归属于5个属18个种，分别为：Enterococcus(1 species)、Lactobacillus(11 species)、Leuconostoc(3 species)，Pediococcus(1 species)和Weissella(2 species)。

传统微生物培养方法不仅费时且受主管因素影响较大，对准确揭示蔬菜发酵过程中微生物多样性存在严重缺陷。随着分子生物学技术的发展，有学者采用聚合酶连变形凝胶电泳(PCR-DGGE)技术研究发酵蔬菜中微生物多样性。李正国[19]采用传统分离培养并结合16SrRNA作为分子标记的DGGE法，分析不同发酵时期榨菜中微生物菌群结构，共获得7个属细菌类群，其中乳酸菌属是优势菌群，明串珠菌属是次优势菌群；通过DGGE方法得到的11条16SrRNA优势条带序列，进行对比结果显示明珠串菌的丰富度最高，是主要优势菌群，乳球菌是次优势菌群；研究证明传统分离法结合DGGE法能够更全面有效地分析榨菜发酵过程中微生物多样性及动态变化情况。Liang等[20]通过利用PCR-DGGE研究不同厂家生产的泡菜中菌群结构，研究发现所有厂家泡菜中均有Lactobacillus、Alkalibacterium、Debaryomyces、Pichia、Candida、Debaryomyces的存在，但每家的优势菌群又不尽相同。从敏等[21]采用PCR-DGGE技术分析东北酸菜发酵过程中细菌的动态变化，结果表明：酸菜发酵第40天多样性指数达最高值，说明此时细菌种群多样性最高；发酵过程中含丰富的乳酸菌，主要的优势菌群为乳杆菌属，包括植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌、棒状乳杆菌、戊糖乳杆菌、唾液乳杆菌以及Iwatensis乳杆菌。其中发酵前期的优势菌群为乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌，而植物乳杆菌为发酵中后期的优势菌种。李超等[22]研究东北酸菜传统自然发酵过程中的真核微生物多样性，在26S rDNA D1/D2区变性梯度凝胶电泳结果显示发酵过程中真核微生物种类丰富。克隆文库揭示发酵第12天时，真核微生物主要为未培养的Stramenopile和土壤真菌，发酵30天时，除上述两类微生物外还包括Candidasake、Cystofilobasidiuminfirmominiatum、未培养Claclosporium和Tilletiopsiswashingtonensis。曹碧璇等[23]研究东北传统酸菜自然发酵液中细菌多样性和群落的组成结构，采用构建16SrRNA基因文库的方法对酸菜成熟发酵液样品进行了研究共获得98个克隆子，经过16SrRNA基因全长序列分析，鉴定为7个属，9个种，分别为Lactobacilluscoryniformis、Pediococcusparvulus、Citrobactermurliniae、Clostridiumintestinale、Lactobacillusmalefermentans、Lactobacillusplantarum、LeuconostoccitreumAchromobacterspanius和Enterobactercloacae其中，乳酸杆菌属(Lactobacillus)片球菌属(Pediococcuss)和枸橼酸杆菌属(Citrobacter)为优势菌，分别占64.29%，22.45%和8.16%，其他种类分别占1.02%～2.04%。田伟等[24]利用16SrRNA基因文库分析传统四川泡菜中的乳酸菌多样性，通过分析共得到129个克隆子，经均鉴定为乳酸菌，分别归属于Lactobacillus和Pediococcus，所占比例分别为88.4%和10.1%；L.pentosus、L.plantarum和P.damnosus是其中的优势菌种分别占50.4%、16.3%和10.1%，L.paraliment-arius、L.sunkii、L.brevis、L.kisonensis、L.acetotolerans、L.namurensis分别占7.8%、4.7%、3.1%、1.6%、0.8%和0.8%，且P.damnosus、L.paralimentarius、L.sunkii、L.kisonensis和L.acetotolerans均在泡菜中发现。Yang等[25]对酸菜发酵过程中微生物动态变化进行了研究，发现发酵体系中存在Leuconostocmesenteroides，Lactobacilluscurvatus，Lact.Plantarum，Lact.Oligofermentans，Candidasake，Cystofilobasidiuminfirmominiatum，Claclosporiumsp.和Tilletiopsiswashingtonensis.在发酵六天后，乳酸菌占到菌群数量的63.8%，第30天的后就只能检测到乳酸菌。Wu等[26]通过研究东北自然发酵酸菜微生物多样性，发现细菌比真菌具有更丰富多样性，其中14种细菌归属于Leuconostoc、Bacillus、Pseudomonas和Lactobacillus，Debaryomyceshansenii、Candidatropicalis和Penicilliumexpansum为真菌优势菌种。

尽管PCR-DGGE技术能够对环境中不能培养微生物进行鉴定，但其存在通量小、分辨能力低、背景噪声影响大和条带分析困难等问题，无法全面分析环境中微生物多样性。近年来Illumina高通量测序技术的出现，可以准确测定环境中微生物多样性，且具有较高通量。佟婷婷等[27]以泡菜母水作引子的蔬菜发酵过程中细菌多样性变化，采集发酵过程中不同发酵时间的样品，提取基因组，PCR扩增16SrRNA的V3+V4区并进行Illumina高通量测序，通过生物信息学分析比较发酵不同时间细菌多样性结果表明：以老坛水作引子的发酵过程中发酵启动时魏斯氏菌属可达到74.5%，而之后则在10%左右，取而代之成为优势菌的是乳杆菌属，含量达到80%～85%说明泡菜发酵中启动菌为魏斯氏菌属，发酵的关键菌为乳杆菌属，同时表明四川泡菜是优良的微生物资源，可用于魏斯氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等益生菌的分离和筛选。张璐璐等[28]利用基于16SrRNA基因高通测序的方法对从贵州、广西和四川采集的28个酸菜样品中的微生物群落进行了分析，结果表明在我国酸菜样品的微生物群落中乳酸菌占据绝对的优势，分布在Lactobacillus、Pediococcus、Lactococcus、leuconostoc和weissela5个属中，并且主要集中在Lactobacillus和Pediococcus两个属中，Lactobacillus在四川，广西和贵州这3个地区的手工酸菜样品中的含量并无显著差异；Pediococcus则重要集中在贵州(52.60%)和四川(43.26%)这两个地区，在广西的手工酸菜样品中的含量比较低，仅有4.25%；Leuconostoc只分布在四川和贵州两个地区，在广西的酸菜样品中并没有检测到；而Weissela和Lactococcus主要分布在四川地区的手工酸菜样品中，在广西和贵州地区的样品中含量很低。在所有酸菜样品中，占据最优势地位的乳酸菌种为Lactobacillusacetotolerans。左勇等[29]利用高通量测序技术对宜宾芽菜6个不同发酵期间的微生物多样性和优势菌群进行研究，共测得22 128 844条序列，通过聚类分析共产生1 198个OTU分类，比较充分地展示了发酵过程中真菌群落结构，并且发现了大量的非培养真菌和未分类真菌。

4 展望

国内外学者相继对发酵蔬菜中的微生物区系、选育优良菌株、发酵条件对微生物活动及有害微生物的影响等进行了相关研究，并取得较好成果。进一步了解微生物区系动态变化，更有助于调控改变微生物菌群和感官品质的低盐发酵。在现代蔬菜加工工艺中人们越来越重视采用优势菌种来实现对产品质量控制，保证产品的安全性和质量的稳定性。

由于传统发酵蔬菜自然发酵过程中微生物区系复杂多变，以往研究采用传统培养方法结合PCR-DGGE技术鉴定微生物种类；但是99%的微生物是难培养或不能培养的，所以传统分离方法对于全面了解泡菜中的细菌多样性具有局限性。近年来，宏观基因组学的发展及应用为揭示复杂体系中微生物的群落结构提供了强有力的工具，但起初由于基因信息数量巨大，受到测序手段的限制，而随着高通量测序技术的发展，人们开始通过对整个泡菜基因组的分析来认识泡菜中的细菌多样性。因此今后微生物多样性研究热点主要集中于利用高通量测序技术研究蔬菜微生态发酵过程，探究菌群与风味、品质之间的深层关系，开发优质接种剂，建立工业可调控系统，从而实现中国发酵蔬菜产业的自动化和产业化。

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[责任编辑 韦志巧]

Research progress of microbial diversity during the fermentation process of traditional fermented vegetables

LI Feng1，SUN Meijuan2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Qiannan Normal College for Nationalities, Duyun， Guizhou558000；2.School of Materials Science and Engineering, Baise University， Baise， Guangxi 533000，China)

The traditional vegetable is one of important products in china, which is fermented by microorganisms. The microbial fermentation has an important effect on the traditional vegetable of quality and flavor. Therefore, it is very important to study the fermentation mechanisms, microbial diversity and the change of nutrients, flavors and chemicals in fermentation process. In this paper, we review the microbial diversity during the fermentation of traditional vegetable. We expect to provide technique data for the industrialization of traditional vegetable in china.

traditional fermented vegetables； microbial； diversity； fermentation

Q93

A

1672-9021(2017)02-0031-05

李锋(1982-)，男，河北石家庄人，黔南民族师范学院化学化工学院讲师，硕士，主要研究方向：微生物功能。

贵州省教育厅自然科学研究重点项目(KY[2014]286)；贵州省科学技术联合基金重点项目(LH字[2014]7418)；广西高校中青年教师基础能力提升项目(2017KY0725)。

2017-01-16