Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微镜的使用研究

狄伶

上海交通大学 分析测试中心，上海200240

Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微镜的使用研究

狄伶

上海交通大学 分析测试中心，上海200240

本文主要介绍上海交通大学分析测试中心配置的Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微镜的组成、技术参数和工作原理，它在Leica TCS SP8共聚焦显微镜基础上搭载了超分辨模块、活细胞工作站和双光子模块，既可以开展纳米水平的亚细胞结构和动力学的研究，也可以观察活细胞中亚细胞器的运动特性及变化，是一个具备多种检测功能的超高分辨共聚焦显微系统。超高分辨率荧光显微技术主要包括基于调制照明光斑以缩小系统的点扩散函数的超分辨技术和基于单分子定位的超分辨技术。同时也简述了样品的制备方法和图像采集的参数设置原则，以及日常维护和管理，具有临床借鉴意义。

激光扫描；Leica SP8 STED 3X；图像采集；共聚焦；显微镜

引言

激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Micros cope，LSCM）是随着计算机技术和光电技术的飞速发展而诞生的新一代显微镜，它不仅能观察固定的细胞和组织切片，还能对活细胞的微观生命活动在分子和离子水平进行实时动态观察，实现细胞形态定位、三维结构重组、定量荧光测定和定量图像分析，在分子细胞生物学领域，尤其是神经生物学、遗传学、生态学和生理学等学科得到广泛应用[1-2]。

生命科学领域近年来逐渐注重动态过程的研究，如细胞迁移、细胞内离子成分的变化等实时生理活动，而当前主要可供活细胞成像的技术主要有：使用复式显微镜（Compound Microscope，CM）或微分干涉显微镜（Differential Interference Contrast Microscope，DIC）观察细胞生长等运动；使用荧光能量共振转移（Förster Resonance Energy Transfer，FRET）和生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）技术动态检测蛋白质相互作用；使用体视显微镜观察成像较大标本；使用荧光染料或蛋白质进行离子成像；使用FRAP技术监控蛋白或囊泡运输；使用全内反射荧光显微镜（Total Internal Refection Fluorescence Microscopy，TIRFM）观察位于或接近细胞质膜变化；使用多光子激光显微镜（Multiphoton Microscopy，MPM）用于神经生物学研究[3-6]。

在神经生物学和遗传发育等学科，很多亚细胞结构、细胞器、生物大分子以及细胞膜内部的生理活动主要发生在几个到几百纳米水平上，而传统的荧光显微镜无法突破衍射极限，难以进行结构小于200 nm的观测，因此对超高分辨率荧光显微技术的需求日益增长。目前的超高分辨率荧光显微技术主要分为两类[7-12]：一类是基于调制照明光斑以缩小系统的点扩散函数（Point Spread Function，PSF）的超分辨技术：其代表是受激发射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED），以及在STED基础上进一步延展的可逆饱和光荧光转移显微技术（Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions，RESOLFT）和基态损耗技术（Grand State Depletion，GSD）；另一类是基于单分子定位的超分辨技术：主要代表是光激活定位显微技术（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）、随机光学重建显微技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）以及荧光活化定位显微技术（Fluorescence Photo Activated Localization Microscopy，fPALM）。除了这两类主流超分辨技术，还有一类重要的活细胞超分辨技术，它是基于结构照明原理的结构光照明显微技术（Structured Illumination Microscopy，SIM）。这几种超分辨技术中，STED技术是在共聚焦显微术的基础上发展起来的纯物理超分辨技术，无需算法后期重构，产生假象的可能性很小；它在光学层析能力、成像深度和速度方面也有一定优势；但相比其他技术，它的激发光功率较大，导致漂白发生的可能性较大；PALM和STORM技术在原理上都是基于荧光分子的光转化和单分子定位，以“时间换空间”，可以获得极高的空间分辨率，并实现单分子分析；但是这类技术是经过计算得到的超高分辨图像，成像时产生假象的可能性较大；SIM技术借助结构光和图像的重构算法得到超高分辨图像，并非完全意义上的超高分辨率技术，假象的概率也比较高，但它对探针的要求少，时间分辨率高、荧光光子利用率高，相对PALM、STED等技术激光功率较弱。

在此基础上，市场上可以进行活细胞成像的超高分辨率显微镜主要两类：一类是以共聚焦为基础的系统：主要是基于STED技术与共聚焦平台相结合的超分辨系统；另一类是以SIM技术为基础的系统：通过栅格移动的照明模式产生包含样本结构信息的干涉图案，进行多次计算的超分辨系统。本文主要介绍上海交通大学分析测试中心配置的Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微镜，它在Leica TCS SP8共聚焦显微镜基础上搭载了超分辨模块（STED）、活细胞工作站和双光子模块，既可以开展纳米水平的亚细胞结构和动力学的研究，也可以观察活细胞中亚细胞器的运动特性及变化，是一个具备多种检测功能的超高分辨共聚焦显微系统。

1 Leica SP8 STED 3X的组成和技术参数

1.1 激光器

1.1.1 单光子激光器

（1）Diode，50 mW：405 nm。

（2）氩离子多线激光器，65 mW：458 nm/ 488 nm/ 514 nm。

（3）DPSS半导体泵浦黄绿光激光器（固体激光器），20 mW：561 nm。

（4）HeNe气体激光器，10 mW：633 nm。

1.1.2 高分辨激光器（STED）

（1）固体激光器，1.5 W：592 nm。（2）固体激光器，660 nm。

1.1.3 双光子激光器：IR Laser Chameleon Ultra Ⅱ：680～1080 nm。

1.2 扫描头

（1）全视野扫描器

性能：在扫描分辨率（Format）为512 pixel×512 pixel、扫描速度1800 Hz、双向扫描（Bidirectional X）开启状态下、针孔为1 AU时帧率达到6.82 fps；最高扫描分辨率可达到8192 pixel×8192 pixel。

（2）共振扫描器8 k

性能：在扫描分辨率为512 pixel×512 pixel、扫描速度8000 Hz（快扫模式）、双向扫描开启状态下、针孔为1 AU时帧率达到27.87 fps；最高扫描分辨率为1024 pixel×1024 pixel。

1.3 荧光显微镜

徕卡研究级共聚焦专用DMi8电动倒置显微镜（Leica TCS SP8），使用灵活性光源组件，配备6款复消色差物镜：10×/0.45 dry、20×/0.75 dry、40×/0.60 dry、40×/1.10 water、63×/1.40 oil、100×/1.40 oil，其中40×/0.60 dry主要用于配合双光子检测使用，它的工作距离在3.3～1.9 mm，适合观察厚样本；100×/1.40 oil主要用于配合超分辨检测。

1.4 活细胞工作站

活细胞工作站为日本东海希多公司的INUG2TF-WSKMSET型（图1），它可以放置常规培养皿/孔板（35/60 mm培养皿、6/12/24孔板），结合可编程的TIME COURSE功能可以实现活细胞的长时追踪，在整个过程中可以提供37 ℃恒温培养和CO2/O2气体。

1.5 操作和分析软件

Leica SP8 STED 3X使用LAS X操作软件，同时配备了串色分离、3D成像、共定位、MicroLab（用于FRAP、FLIP、FRET实验）、环境控制等功能模块，以及用于长时追踪可编程的HCS A Single Obj Tracking SP8/ HCS A Multiwell SP8软件模块。

图1 活细胞工作站

1.6 工作原理

LSCM的工作原理：以激光作为光源，通过点对点的扫描方式逐一聚焦在样品焦平面某点上，该点所发射的荧光经检测针孔被光电倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）所采集，由计算机转化形成荧光图像。点对点的扫描方式和针孔对非焦平面以及焦平面上的非焦点光斑信息的阻隔，有效提高了图像的分辨率和清晰度。光路中的扫描系统不仅可以在样品焦平面上扫描，还可以沿Z轴上下移动形成新的共焦平面，由此得到不同层面连续的光切图像，形成三维图像。

2 激光共聚焦显微镜样品制备

2.1 样品预处理

Leica SP8 STED 3X可以观察细胞爬片（活体或固定样品均可）、组织切片、植物根/茎/叶/花/果/纤毛的切片、酵母或细菌、以及具有自发荧光的合成材料、胶束、自组装小分子和金颗粒等。

（1）细胞、组织等样品应根据样品种类和实验需求选择不同的固定方法[13]，活细胞、较厚的组织切片或不规则的组织块需使用共聚焦专用的培养皿，尤其是在使用高倍镜时，共聚焦专用的培养皿可以提供更清晰的图片；盖玻片应选择厚度为0.17 mm的，最好使用共聚焦专用的盖玻片，市售盖玻片建议彻底清洁，可使用浓硫酸/高锰酸钾溶液浸泡清洗；

（2）植物的根/茎/叶/花/果/纤毛等新鲜的植物组织，可以先在体视显微镜下剖离出待观察的部位，再进行显微观察。对于比较厚的植物组织，可根据文献探索合适的透明化处理条件，以获得更好的观察；

（3）对于需要切片的细胞、组织或植物，切片的最大厚度取决于物镜的NA值、物镜的工作距离(Work Distance，WD)、激光的穿透力和样品的透明度，以10×/0.4物镜为例，厚度大约在1 mm；切片的最小厚度主要取决于物镜的NA值、针孔大小和发射波长，以配备Super Z的显微镜为例，其最小移动步距是3 nm，则Z轴分辨率在350 nm。

（4）酵母等非贴壁生长的微生物，需先做贴壁处理再进行观察。以酵母为例[14]，在皿底预先涂一层能和酵母细胞壁的多糖类物质结合的伴刀豆蛋白溶液，再加入酵母溶液，静置后弃去并洗去未贴壁酵母，加入PBS溶液后进行显微观察，可以得到较好的图片。其他悬浮生长的微生物可根据自身特性，选择合适的贴壁涂层材料。

（5）对于具有自发荧光的材料，不需特别的制备方法，直接滴加或放置少量样品于盖玻片上进行观察。液体或胶束可用移液枪吸取3～5 µL，静置数分钟后观察，以避免视野里飘动的样品干扰观察。

（6）观察的过程中如果荧光淬灭现象比较严重，可以根据样品的种类和特性选择合适的抗荧光淬灭剂。

2.2 荧光染料的选择

荧光染料是一类能发出荧光的染料，通常情况下，吸收一定波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光光波的物质，在生命领域主要用于示踪。荧光染料的选择可参考激光共聚焦显微镜所配的激光器，405 nm激光器可观察DAPI、Hoechst 和Alexa-405系列染料；氩离子激光器可观察 GFP、CFP 和 YFP 等荧光蛋白，FITC、Alexa-488等染料；561 nm激光器可观察RFP等荧光蛋白，及Rhodamine、Alexa-546、Cy3等染料；633 nm激光器可观察Alexa-647和Cy5等染料。各大仪器公司的主页也会有相应的染料光谱数据以供参考。在做超分辨观察时，如果使用技术研发团队自行开发的染料，将获得更高的成像效果和分辨率。荧光染料可以单独使用，也可以组合使用，进行多重标记时，要尽量避免染料之间的串色，还要考虑各种抗体的来源，使用不同种属来源的抗体进行染色，并优先选择稳定性和抗淬灭性强的染料。

3 图像采集参数设置

3.1 扫描分辨率

（1）与物镜NA值和检测波长有关[15]。在固定的物镜倍率和Zoom下，扫描密度越高，即采样点越多，图像越细腻，但是速度会越慢，荧光强度也会越低，样品淬灭的几率也越大。Leica SP8 STED 3X的默认值是512 pixel×512 pixel，一般在预览模式下使用这个分辨率，可以方便我们更快的选择视场、调制拍照的参数，也可以选择更低的分辨率进行预扫；在采集正式数据时可以选择更高的分辨率以获得更好的图片质量（图2）。受限于计算机显示屏的分辨率，通常用于发表文章的分辨率为1024 pixel×1024 pixel，因为这个分辨率与更高的相比直观看去并无明显差异。

（2）根据Nyquist-shannon采样定律，像素点大小应为物镜XY平面分辨率的40%～50%。像素点随扫描分辨率增大和Zoom的增加而减小。与高倍物镜相比，低倍物镜需要更高的扫描分辨率。

3.2 图像亮度（信号强度）

（1）与物镜NA值和针孔大小有关。当NA值相同时，倍率越高，亮度越低；针孔越大，图像越亮，但清晰度会下降，一般我们选择针孔尺寸等于1时进行拍照，根据样品的实际情况再做以调整。

（2）与激发光的强度有关。激光强度越高，图像越亮，但样品也更容易淬灭，原则上在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。

（3）与接收发射荧光的带宽有关。在荧光发射光谱范围内，增大采集的带宽会使图像更亮。

（4）与PMT有关。PMT的增大可使信号和噪音同步增强，在保证图像质量的前提下，增益（Gain）值越小越好；Gain值的正常范围为 0～1250，我们在实际的检测工作中，一般使其小于800；对于配备HyD检测器（Hybrid Detector）的共聚焦显微镜，一般使Gain值小于100%，以避免损伤检测器；

（5）可通过采集的平均次数来降噪。线平均（Line Average）和面平均（Frame Average）是两种降低背景噪音的方式，可在拍照时结合样品的情况设置平均参数，使图像背景更干净。

（6）可使用数码增益和数码降噪。对拍好的照片，使用软件自带的编辑功能及拖拉信号/背景工作条可以得到一定程度的背景降噪（图3）。

此外，设置以上参数时应避免图像出现过曝和曝光不足，按LUT按钮，在图像优化模式下，仅使少数点呈蓝色（过曝），背景呈绿色，以保证图像质量和后期的数据分析（图4）。

3.3 荧光的定量

由于荧光强度与特异性荧光标记蛋白的表达量成正相关，因此可以通过分析荧光强度进行定量分析。在共聚焦软件的Quantify模块，Intensity工具可以针对不同通道、同一焦平面的不同感兴趣域(Region of Interest，ROI)进行荧光强度的量化分析，对于不同焦的数据也可以进行分析（图5）。

3.4 三维层切及重构

此功能可以分层观察并重构整个扫描区，特殊合成的小分子或具有靶向性/特异性的物质进入细胞，通过三维重构可以直观的看到材料在亚细胞器不同焦面和部位的分布。

图2 植物茎(Convallarla rhizome，样片)切片在不同扫描分辨率下的照片

图3 植物茎切片照片降噪(Noise Reduction)后的图片

图4 理想的荧光图像

图5 荧光定量分析

3.5 时间序列扫描

时间序列扫描多用于活细胞成像，记录其动态过程。可以通过软件设置拍照的频率和拍照的采集位点，也可以在多个位点进行记录。在活细胞长时观察实验中，我们最久连续观察过7 d，为了避免污染，观察过程中没有做换液处理。

3.6 光谱扫描

光谱扫描最常被用于进行串色分离，因为植物类样品以及老龄化较明显的细胞会有比较严重的自发荧光现象，对有干扰的荧光使用这个功能可以得到良好的改善。此外，光谱扫描也被用于对研发的新染料进行发射光谱的采集（图6）。

图6 染料的发射光谱图

3.7 自动拼接

对于脑片等厘米级别的生物样本，笔者常使用自动拼接功能，结合AFC和BEST FOCUS功能对样本进行扫描，最后的图片由每一块独立的扫描区域拼接而成。如果样品本身不平整或标记不均匀，拼好的图像会有比较明显的图缝间隙，可使用Zoom功能，对每个区域稍做放大，同时层扫后累加各层图像，可以较好的改善脑片厚度不均一和荧光区域焦平面各异所导致的图像明暗不均，获得更好的数据（图7）。

图7 植物茎切片层扫后累加各层图像并进行自动拼接拼接区域2×2

3.8 双光子荧光成像

双光子荧光成像技术采用长波激发光，以脉冲激光的方式使两个或多个光子同时到达被激发的电子，穿透深度比单光子更深，能实现组织深层次成像。原则上，采用合适的波长（两倍单光子激发波长）即可达到激发条件，结合样品的透明化处理和专用的长工作距离物镜，可以得到背景干扰低、成像深度达2～3 mm的图像，如果进行双面拍摄再拼接，深度可以达到4～6 mm。Leica SP8 STED 3X配备的镜头是40×/0.60(WD 3.3～1.9 mm)，观察经透明化处理的脑块，能得到很好的成像效果（图8）。此外，由于双光子的长波激发能使特殊合成的小分子在特异性的波段产生发射光谱，部分研究材料和小分子的课题组也逐渐关注并使用双光子成像技术。

图8 脑块三维重构图

3.9 超分辨成像

STED技术可以理解为两束具有同轴光路的激光共同作用于一个位点，一束用于激发荧光物质得到荧光(圆斑状)，另一束环状激光使圆斑外周部分区域受激发射(圆环状)，中心无重合的荧光区域被采集，两束激光重合的受激发射区域被滤光片阻挡，从而获得了尺寸更小的光斑。这个技术通过控制环状激光的大小，可以得到足够小的无重合区域，再结合白激光的使用，分辨率能得到极大的提高，一般情况下XY平面分辨率可以达到50 nm以下，Z轴分辨率可到130 nm以下，获得比常规共聚焦图片更多的有效科学信息（图9）。

图9 共聚焦与使用STED技术的超分辨图片对比

3.10 数据的后期处理及去卷积

图像质量主要受噪声、散射、眩光和模糊等因素影响，其中散射和眩光是随机发生的由光学元件和样品本身所引起的干扰，可通过对光学元件进行抗反射涂层处理加以改善；而噪声和模糊是非随机发生的干扰，由光学镜片和信号本身或成像系统引起，市场上有多款相应的软件可以改善。Leica SP8 STED 3X配备的是荷兰Scientific Volume Imaging（SVI）公司的Huygens去卷积软件，可以有效去除非焦平面上的模糊和噪声，增加图片的对比度和分辨率，使图片反映更多结构信息。

4 激光共聚焦显微镜的维护和管理

4.1 日常维护注意事项

（1）严格遵守仪器的操作流程，尤其是正确的开/关机流程，避免因操作不当造成的仪器硬件的损坏。在关机环节，应特别注意氩离子激光器需充分冷却，应等待风机关闭后再关闭Laser Power按钮[16]。

（2）置于显微镜下观察的样品，很多都是微小透明的，这些样品即使出现在显微镜视野里也不易被察觉，一般镜头的焦距可被察觉的距离非常短，初学者很难找到焦距，因此在操作过程中，尽量在微调模式下（Fine）进一步调焦，并且每次使用完毕做好清洁工作。载物台、物镜、目镜等应经常用擦镜纸蘸取清洁液擦拭。

（3）在观察过程中，对于激光器的选择应根据所使用的染料，以延长不必要使用的激光管的寿命。氩离子激光器建议不使用时不开启。

（4）如果双光子激光器不常使用，可每月启动激活一次，启动期间保持激光器常开，即激光开关钥匙在On状态48 h再关闭。

（5）应避免在一天中反复多次开关机，实验间隙超过半小时，可将激光开关钥匙由On旋转至Off，硬件和软件系统保持开启。

（6）图像和数据资料应使用刻录光驱刻录，严禁使用U盘，防止电脑中毒。

（7）光学元件对环境温湿度的要求比较高，室内温度应保持在（21±2）℃，湿度 40%～60%，在雨季应开启除湿机，在春夏秋季开启空调。

4.2 激光共聚焦显微镜的平台管理

Leica SP8 STED 3X激光扫描共聚焦显微镜由上海交通大学分析测试中心定制的仪器共享平台统筹管理。仪器的日常使用、培训和功能开发等由专职技术人员完成，使用者经过实名注册，网上预约来使用仪器。这台共聚焦显微镜自2016年3月投入使用以来，已服务全校7个学院24个课题组，面向的研究领域不仅有生命科学，还包括材料、化学、微纳科学等专业，正逐渐为各领域学科所使用。

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本文编辑 苏欣

Research of Using Laser Scanning Confocal Microscopy Leica SP8 STED 3X

DI Ling
Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

This paper mainly introduced the components, technical parameters, working principle of confocal laser scanning microscope Leica SP8 STED 3X equipped in the Instrumental Analysis Center of Shanghai Jiao Tong University. This microscope, based on the Leica TCS SP8 confocal microscope, is equipped with super resolution model - stimulated emission depletion, live cell station and two-photon module; it can be used to carry out nano-level sub-cellular structure and dynamics study, and can also be used to observe subcellular organelle movement characteristics and changes of living cell, is a ultra-high resolution confocal microscopy system of various detecting functions. Ultra-high resolution fuorescence microscopy includes super-resolution technology based on modulation of light spot to reduce point spread function of the system, as well as super-resolution technology based on single-molecule localization. Meanwhile, preparation method of the sample, parameter setting principle of the image capture, and the routine maintenance and management, were also discussed, which has great significance in clinical practice.

laser scanning; Leica SP8 STED 3X; image capture; confocal; microscope

TH742；TP273

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.02.003

1674-1633(2017)02-0009-07

2016-11-10

科技创新专项基金（AF4040004）。

王瑾晔，教授。

通讯作者邮箱：jinyewang@sjtu.edu.cn