盐酸克伦特罗完全抗原的鉴定

陈艺宏，张琛卿，贺延志，张宏，王玉帅，李昊

（福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）

盐酸克伦特罗完全抗原的鉴定

陈艺宏，张琛卿，贺延志，张宏，王玉帅，李昊*

（福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）

为制备并鉴定盐酸克伦特罗（CLB）完全抗原CLB-BSA，采用重氮法将盐酸克伦特罗（CLB）和牛血清白蛋白（BSA）进行偶联，通过SDS-PAGE凝胶电泳、紫外全波长扫描、傅里叶红外光谱法等进行鉴定，现有盐酸克伦特罗完全抗原鉴定方法未曾采用过傅里叶红外光谱法。结果表明：本方法成功地制备了完全抗原，偶联比在9～13。通过投料比与偶联比关系的探究，可知当CLB与BSA的投料比例小于80∶1时，偶联比随着投料比例的增加而升高，但当投料比大于80∶1时，偶联比反而下降，为了节约成本，投料比应控制在80∶1以下。

盐酸克伦特罗；完全抗原；制备；鉴定；偶联比

盐酸克仑特罗（Clenbuterol Hydrochloride，CLB）是一种β2-兴奋剂，也称为β2-肾上腺素受体激动剂。其与肾上腺素有着相同的药效作用，主要用于支气管哮喘、支气管痉挛和阻塞性肺炎等疾病的治疗。由于CLB有营养重新分配的效应，在1980年代初，一家美国公司开始在饲料中添加该物质。CLB能显著提高瘦肉的转化率，因此，β2-肾上腺素受体激动剂也被称为“瘦肉精”。若人食用了含CLB的食物，在很长一段时间之后，可能会出现头痛、胸闷、恶心等症状[1]。2007-2014年，由瘦肉精引起的食物中毒事件多达52起以上，主要集中于广东、浙江、福建、湖南四省。瘦肉精中毒的食物来源主要是猪肉和猪内脏，最高添加量达到了280mg/kg[2]。

目前，用于检测CLB的方法有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、酶联免疫检测法、胶体金免疫层析检测法等方法，其中酶联免疫检测法、胶体金免疫层析检测法是较为便捷的检测方法，不但无需使用昂贵的仪器设备，而且检测速度快，实用性强。2种检测方法的原料主要是高效的免疫原和特异性强的抗体，CLB是一种小分子物质，无免疫原性，因此，需要和大分子蛋白载体进行偶联获得免疫原性。本文利用重氮法将小分子CLB与牛血清白蛋白（BSA）进行偶联，通过各种鉴定方法，尤其是红外光谱法，确证了偶联的成功。此前红外光谱法还未有过采用红外光谱法鉴定盐酸克伦特罗完全抗原的先例。由此获得了完全抗原CLB-BSA，为进一步制备出高特异性抗体奠定了坚实的基础。

1 试验部分

1.1 材料

盐酸克伦特罗标准品（含量99.0%），NaNO2、HCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4和KCl（分析纯），牛血清白蛋白（BSA），淀粉碘化钾试纸，福建蓝昊生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

pH计（PB-10A型），德国Sartorius公司；电子天平（FA1104N型），上海天平仪器厂；磁力搅拌器（90-1型），上海精科实业有限公司；电泳槽(Miniprotean 3型)，美国伯乐太平洋有限公司；恒压恒流电泳仪（PowerPacTM Basic型），美国伯乐太平洋有限公司；凝胶成像系统（JS-680D型），上海培清科技有限公司；全波长扫描紫外-可见分光光度计（Cary 50型），美国瓦里安技术中国有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet 380），美国热电公司；压片机（YR-2型），上海山岳科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机（FD-1A-50型），北京博医康实验仪器公司。

1.3 完全抗原CLB-BSA制备

1.3.1 重氮化反应

将0.3mol/L的盐酸溶液和0.2mol/L的NaNO2在4℃中预冷0.5h；称取3mg CLB标准品溶于预冷的1mL盐酸溶液中，在冰浴中搅拌；将已预冷的0.2mol/L的NaNO2匀速滴加到CLB溶液中，反应过程中用碘化钾淀粉试纸检测，直至试纸变成深紫色为止才停止加入（应保持试纸在滴加后0.5～2.0s内读试纸），之后继续搅拌30min，反应过程中要避光和冰浴，且搅拌速度要保持低转速，因为重氮盐见光易分解，所以反应过程的避光尤其重要。反应式如图1所示。

图1 重氮化反应式

1.3.2 重氮偶联反应

称取40mg BSA溶于20mL pH9.5的0.1mol/L碳酸盐缓冲液中，将重氮化的CLB缓慢逐滴加入该溶液中。滴加结束后继续在4℃条件下暗处反应24h，反应式如图2所示。

图2 重氮偶联反应式

1.4 透析

反应结束后，将上述反应液取出装入透析袋中，把透析袋两侧扎紧放入盛有1L PBS（0.01mol/L，pH7.4）的大烧杯中在4℃冰箱中透析，透析3d，每天换两三次透析液；将离心后的CLB-BSA溶液置于真空冷冻干燥机冻干，冻干后置于4℃保存备用[3，4]。

1.5 SDS-PAGE法鉴定完全抗原CLB-BSA

各取10μL稀释过的BSA溶液和CLB-BSA溶液至EP管，加入等体积的还原性样品处理液，将其和含蛋白Marker的EP管置于沸水中爆沸约3min，低速离心；分离胶浓度为12.5%；然后，将各管样品处理液和蛋白Marker上样；之后，用恒压80V电泳30min后，改120V继续电泳，当溴酚蓝指示剂接近胶体底部时停止电泳[5，6]。

1.6 紫外全波长扫描法鉴定完全抗原

将BSA溶于0.01M pH7.4的PBS中，配置成0.5mg/mL的BSA溶液；将CLB溶于0.01M pH7.4的PBS中，配置成0.1mg/mL的CLB溶液；将偶联物CLB-BSA溶于0.01M pH7.4的PBS中，配置成0.5mg/mL的CLB-BSA溶液；对BSA、CLB和偶联产物CLB-BSA溶液进行200～400nm的紫外全波长扫描[5]。

1.7 傅里叶红外光谱法鉴定完全抗原

称取3份约200mg的KCl，每份分别加入2mg CLB、BSA和偶联产物CLB-BSA（冻干粉），作为检测样品；取适量KCl，研磨成细粉末，压成1～2mm厚的薄片，进行背景扣除；分别取适量的各样品，研磨成细粉末，压成1～2mm厚的薄片，进行红外光谱扫描。

1.8 投料比与偶联物偶联比实验

用不同投料比例制备完全抗原CLB-BSA，设置CLB与BSA的摩尔比分别为20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1。用紫外可见分光光度计扫描CLB和BSA的最大吸收波长。将CLB和BSA分别在两者的最大吸收波长下测得4个浓度-吸光值标准曲线，从标准曲线中取得相关系数（与摩尔消光系数成正比）。根据式（1）求取偶联比[7]：

式（1）中，A294.9、A278为偶联物CLB-BSA分别在CLB、BSA最大吸收波长下的吸光值；KCLB-294.9为CLB、BSA在其最大吸收波长下的相关系数；KBSA-278为BSA在其最大吸收波长下的相关系数；KCLB-278为CLB在BSA最大吸收峰波长处的相关系数；KBSA-294.9为BSA在CLB最大吸收峰波长处的相关系数。

2 结果与讨论

2.1 SDS-PAGE电泳法鉴定完全抗原CLB-BSA

重氮化的CLB可以通过偶氮键与蛋白载体酪氨酸残基上的酚羟基邻位相连并形成稳定的偶合物。载体蛋白BSA的蛋白分子量约为66.446kDa，CLB的分子量为313.650kDa，BSA上有19个酚羟基残基[8]，若偶联反应成功，则一分子的BSA能偶联上几个甚至十几个CLB分子，其分子量能增加上千个分子量。将载体蛋白BSA和偶联产物CLB-BSA稀释一定倍数进行SDS-PAGE凝胶电泳，如图3蛋白电泳结果所示，CLB-BSA条带指示的分子量比BSA的略有增加，说明小分子与载体蛋白的偶联成功。

图3 BSA和CLB-BSA的SDSA-PAGE凝胶电泳图谱

2.2 紫外全波长扫描法鉴定完全抗原

对BSA、CLB和偶联产物CLB-BSA溶液进行200～400nm的紫外全波长扫描，如图4紫外全波长扫描图谱所示，偶联物CLB-BSA的波形与BSA和CLB的波形不同，CLB-BSA的最大吸收峰与CLB和BSA的最大吸收峰相比均略左移动，三者的最大吸收峰分别为275.0、294.9、278.0nm。说明CLB和BSA偶联反应后，两者的吸收峰产生了叠加效应，导致偶联物的最大吸收峰与CLB和BSA相比产生了位移。根据这一图谱的现象可以推断CLB与载体蛋白BSA产生了偶联反应，获得了完全抗原CLB-BSA。

图4 BSA、CLB、和CLB-BSA的紫外全波长扫描图谱

2.3 傅里叶红外光谱法鉴定完全抗原

将CLB、BSA和偶联产物CLB-BSA（冻干粉）进行傅里叶红外扫描，如图5所示，对比BSA、CLB及两者的偶联产物CLB-BSA的图谱可以看出，CLB在2 500～2 400/cm和1 120～700/cm有多个特征吸收峰，而BSA的红外扫描图谱上无此特征吸收峰，而偶联产物在保留BSA特征吸收峰的同时，也具有在2 500～2 400/cm和1 120～700/cm的特征吸收峰。傅里叶红外扫描图谱结果证明，偶联反应的产物同时具有CLB和BSA的特征吸收峰，说明了产物为CLB和BSA两者的偶联物。

图5 BSA、CLB、和CLB-BSA的红外扫描图谱

2.4 计算偶联比的相关系数

通过紫外全波长扫描，已知CLB的最大吸收峰为294.9nm，BSA的最大吸收峰为278nm，将CLB、BSA的梯度溶液在紫外294.9nm和278nm下测吸光度值，可作出4个标准曲线，如图6所示。

图6 （a） CLB在紫外294.9nm的标准曲线

图6 （b） CLB在紫外278nm的标准曲线

图6 （c） BSA在紫外278nm的标准曲线

图6 （d） CLB在紫外294.9nm的标准曲线

根据偶联比计算式（式1），可知要计算偶联比需要先求得KCLB-294.9、KBSA-278、KCLB-278、KBSA-294.9的值，通过4个标准曲线的斜率可以计算出这4个相关系数，如表1所示。

表1 偶联比计算的相关系数

2.5 物料比对偶联物偶联比的影响

由于载体蛋白上参与偶联反应的位点是有限的，因此偶联比不会随着投料比的增加而无限增大，而BSA上能与重氮化CLB结合的位点只有19个，因此，为了节约成本，应考虑投料比与偶联比的关系。将CLB与BSA的投料比（摩尔比）分别为20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1，进行完全抗原的制备，根据式（1）计算出每组的偶联比。如图7所示，制备的偶联产物的偶联比在9～13，当CLB与BSA的投料比例小于80∶1时，偶联比随着投料比例的增加而升高，但当投料比大于80∶1时，偶联比反而下降。原因可能是大量CLB竞争性地与BSA结合时，形成了空间位阻，反而不利于CLB与BSA的结合。因此，当利用重氮法偶联CLB和BSA时，应该控制投料比在80∶1以下，以免浪费原料。

图7 投料比与偶联物偶联比的关系

3 结论

CLB为小分子物质，无免疫原性，采用重氮法将CLB与BSA相偶联制备完全抗原，并通过SDSPAGE凝胶电泳、紫外全波长扫描对制备结果进行了鉴定，初步证明了偶联的成功。已有的CLB完全抗原鉴定方法中未见到采用傅里叶红外光谱法的例子，因此，本试验还对盐酸克伦特罗完全抗原的制备情况进行傅里叶红外光谱扫描，根据CLB、BSA和CLB-BSA的特征吸收峰的对比，有利地证明了CLB和BSA的成功偶联。该方法制备的完全抗原偶联比为9～13，通过投料比与偶联比关系的探究，可以得出投料应控制在80∶1以下。

根据BF Erlanger所述，半抗原偶联到载体上的数目在8～25作为免疫原较为合适[9]，而本方法制备的完全抗原偶联比正好在这个范围内，可以进而对动物进行免疫，制备CLB多克隆抗体和单克隆抗体，为研制检测CLB的酶联免疫试剂盒和胶体金免疫检测试纸条奠定基础。完全抗原的偶联比对抗体的滴度有影响，但是最佳偶联比目前还没有定论。因此，后续的试验将把各种不同偶联比的CLB完全抗原对动物进行免疫试验，从而确定最佳偶联比。

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Identification of Complete Antigen for Antibody Production Against Clenbuterol Hydrochloride

Chen Yi-hong, Zhang Chen-qing, He Yan-zhi, Zhang Hong, Wang Yu-shuai, Li Hao*
(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fujian Fuzhou 350118)

To prepar and identificate complete antigen of Clenbuterol Hydrochloride (CLB), a conjugate of Clenbuterol Hydrochloride (CLB) - Bovine Selllm Albumin(BSA) was synthesized by diazotization method, and identified by SDS-PAGE gelelectrophoreses, UV full-wavelength-scanning spectrum and fourier infrared spectroscopy. It haven’t been used fourier infrared spectroscopy to identificated complete antigen of Clenbuterol Hydrochloride(CLB) presently. The result showed that the complete antigen was prepared successfully, the conjugated ratio of CLB to BSA was between 9 to 13. By exploring the relationship of CLB/BSA in feed on and coupling ratio CLB/BSA, it was concluded that coupling ratio increased with the feed ratio, when feed ratio of CLB with BSA was less than 80∶1, but coupling ratio declined when the feed ratio was more than 80∶1. For saving the cost, the feed ratio should be controlled below 80∶1.

Clenbuterol hydrochloride; Complete antigen; Preparation; Identification; Coupling ratio

S859.84

A

2096-0387（2017）01-0005-05

陈艺宏（1991-），女，福建漳州人，在读硕士研究生，研究方向：抗体筛选及应用。

李昊（1968-），女，，黑龙江齐齐哈尔人，博士，教授，研究方向：生物制药技术、食品安全检测技术、生物活性肽促进动植物干细胞增殖、抑制肿瘤细胞增殖的活性及机制研究。