超声对改性明胶固定化木瓜蛋白酶活力的影响

白 鸽,郑德娟,张 杰,陈 雪,曹雁平,2,*

(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048;2.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

超声对改性明胶固定化木瓜蛋白酶活力的影响

白 鸽1,郑德娟1,张 杰1,陈 雪1,曹雁平1,2,*

(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048;2.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

本文探讨了超声处理对戊二醛改性明胶包埋的木瓜蛋白酶酶解反应条件以及酶学特性的影响。采用均匀实验的方法优化超声处理固定化木瓜蛋白酶的反应条件。利用偏最小二乘回归法分析均匀实验结果,得到最优条件为:135 kHz、0.05 W/cm2、20 min、40 ℃,此条件下实测相对酶活为221.25%,与理论值相对误差为3.58%。超声并没有改变固定化酶的最适pH和最适温度,即超声并不改变固定化酶的酶学特性。

超声,固定化木瓜蛋白酶,酶活力

明胶是动物胶原蛋白部分水解后的产物。它是一种非常重要的高分子材料,具有可降解、抗原性低、组织相容性好等优点[1]。毛跟年等[2]用明胶作为载体,固定化乙醇脱氢酶,其稳定性增强,酶活损失小,10次使用后相对酶活仍能保证52.89%。高启禹等[3]用明胶作为固定化木聚糖酶的载体,使其热稳定性得到显著提升,扩大了应用范围。但由于明胶存在机械性能不足、热稳定性差等缺点,通常将其改性后使用,以扩大其应用范围[4]。明胶改性方法主要有物理改性法、化学改性法和共混改性法。戊二醛作为明胶改性剂之一,具有反应快,机械强度高,产品稳定等优点[5],是最常用的明胶改性方法。陈书霖等[6]发现经戊二醛改性后,使明胶膜的耐水性和阻湿性显著提高。

明胶是一种良好的固定化酶载体材料。固定化酶与游离酶相比,具有可重复使用,稳定性好,便于回收的优点[7]。但是由于立体屏蔽、微扰动、分配效应、扩散限制效应等因素的影响,会降低固定化酶的酶活力[8]。有实验表明适当的超声处理会提高固定化酶的反应速率,提高酶活[9]。Badgujar等[10]发现超声可以提高固定化脂肪酶的酶活,与非超声相比,超声处理后酶活提升4.5倍。Wang等[11]发现超声可以提升固定化酶的活力,从而加快菜籽蛋白的酶解,超声处理后的水解度增加了74.38%。Costa等[12]发现高强度的超声可以有效提高固定化胰蛋白酶水解蛋白质的效率,消化率提升了11倍。

本文采用戊二醛改性后的明胶,利用包埋-交联法得到固定化木瓜蛋白酶,研究超声频率、超声功率、超声时间、超声温度对固定化木瓜蛋白酶的影响,以及超声对固定化酶酶学特性的影响。本研究为固定化木瓜蛋白酶的工业应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明胶、25%溶液戊二醛、无水碳酸钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、三氯乙酸、醋酸丁酯 国药集团化学试剂有限公司;福林酚试剂、木瓜蛋白酶(测定活力4.96×105U/g) Sigma公司;干酪素 北京奥博星生物技术有限责任公司;L-谷胱甘肽 拜尔迪生物技术有限公司。

JXD-02型多频槽式处理系统 北京金星超声波技术设备有限公司;DC-2006型低温恒温水浴 浙江宁波新芝生物科技股份有限公司;UVmini-1240型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;CP214电子分析天平 上海市奥豪斯仪器有限公司;FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省巩义市予华有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制备 称取4 g明胶溶于20 mL pH=8的磷酸盐缓冲液中,磁力搅拌加热至完全溶解,在一定温度下缓慢加入0.5 mL,0.5%戊二醛溶液,反应25 min后,加入0.5 mL 0.5%戊二醛溶液,反应10 min[13],冷却至40 ℃左右,缓慢加入0.5 mL酶液(10 mg/mL),再加入0.5 mL 4%戊二醛溶液,反应30 min,将混合溶液滴加到不断搅拌的冷的(0 ℃)醋酸丁酯中,通过调节转速控制球珠的大小(4±1)mm,形成球珠后捞出浸泡在100 mL 0.5%戊二醛溶液中,4 ℃冰箱贮藏30 min后[14],水洗三遍,滤干,放置在冰箱中备用。

1.2.2 超声处理固定化木瓜蛋白酶单因素实验

1.2.2.1 超声频率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 为研究超声频率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响,超声频率分别为28、40、50、135 kHz,超声功率为0.45 W/cm2,超声温度为40 ℃,分别进行酶促反应10 min,测定酶活力。

1.2.2.2 超声功率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 为研究超声功率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响,超声频率为135 kHz,超声功率为0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 W/cm2,超声温度为40 ℃,分别进行酶促反应10 min,测定酶活力。

1.2.2.3 超声时间对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 为研究超声时间对固定化木瓜蛋白酶活力的影响,超声频率为40 kHz,超声功率为0.15 W/cm2,超声温度为40 ℃,超声时间分别为10、15、20、25、30 min,测定酶活力。

1.2.2.4 超声温度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 为研究超声温度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响,超声频率分别为40 kHz,超声功率为0.15 W/cm2,超声温度为30、40、50、60、70 ℃,分别进行酶促反应20 min,测定酶活力。

1.2.3 超声处理固定化木瓜蛋白酶酶活力条件的优化 根据单因素实验结果,选取超声频率、超声功率、超声时间、超声温度4个因素,利用DPSv15.10数据处理系统进行实验因素设计混合水平均匀实验优化超声处理固定化木瓜蛋白酶活力的条件。

表1 实验因素水平表Table 1 Factors and levels for the trial

1.2.4 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适条件的影响

1.2.4.1 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适pH的影响 固定化木瓜蛋白酶分别与pH=6、6.25、6.5、6.75、7的酪蛋白在非超声(水浴)和超声条件下进行反应。非超声与超声反应温度均为40 ℃,反应时间为20 min,超声频率为135 kHz,超声功率为0.05 W/cm2。反应后测定酶活。

1.2.4.2 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适温度的影响 固定化木瓜蛋白酶与酪蛋白在最适pH的条件下,分别在30、40、50、60、70 ℃的体系温度下反应,测定最适温度。非超声与超声反应时间均为20 min,超声频率为135 kHz,超声功率为0.05 W/cm2。反应后测定酶活。

1.3 酶活力测定方法

参照福林酚法[15]测定固定化酶活力。

式(1)

式中:E1为超声后固定化木瓜蛋白酶的活力;E0为非超声固定化木瓜蛋白酶的活力。

1.4 数据处理

实验中每个处理重复三次,实验各值均为三个平行数据的均值。采用DPSv15.10数据处理系统进行均匀实验设计。数据统计结果与分析应用Microsoft Excel 2007和Origin 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 超声处理对固定化木瓜蛋白酶活力的影响

2.1.1 超声频率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 使用不同频率的超声对固定化木瓜蛋白酶进行处理,结果如图1所示。

图1 超声频率对固定化木瓜蛋白酶相对酶活力的影响Fig.1 Effect of ultrasound frequency on the relative enzyme activity of immobilized papain

由图1可知,随着超声频率的增大,相对酶活呈现先增大后减小的趋势,经过28、40、50、135 kHz超声处理,相对酶活力分别为171.99%、219.95%、169.35%、143.73%,较非超声处理时的酶活力都有所提高,并在40 kHz处达到最大值,相对酶活为219.95%。王振斌等[16]发现超声预处理中固定化纤维素酶随着超声频率的增大,其酶活性先升高后降低,并在24 kHz处取得最大值。Badgujar等[10]发现固定化脂肪酶随着超声频率的增加呈现先增加后减小的趋势,并在33 kHz处达到最大值,与本研究的趋势一样。随着超声频率的增加,声波膨胀时间会变短,空化核尚未增长到产生空化作用的尺寸,或空化泡即将形成但因压缩时间短,空化气泡来不及收缩便崩塌,以致空化效应不明显。但并不是频率越低越好,过低的频率会使气泡存在时间过长,产生的自由基与固定化酶相结合,会使酶活下降。由此可见适宜的超声处理产生的空化作用会提升固定化酶的活力。

2.1.2 超声功率对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 使用不同功率的超声对固定化木瓜蛋白酶进行处理,结果如图2所示。

图2 超声频率对固定化木瓜蛋白酶相对酶活力的影响Fig.2 Effect of ultrasound power on the relativeenzyme activity of immobilized papain

由图2可知,随着超声功率的增大,相对酶活呈现先增大后减小的趋势,并在0.15 W/cm2处达到最大值,相对酶活为275.85%。Govind等[17]发现超声可以促进固定化酶的酶活,并且随着超声功率的增加,酶活力呈现先增大后减小的趋势,并在100 W时超声作用最明显。朱国辉等[18]发现经超声不同功率处理菠萝果蛋白酶的酶活较非超声均有所增加,且最适功率为100 W,超声功率再增加,酶活反而会有所降低,这与本研究的趋势一致。

2.1.3 超声时间对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 在不同的时间下超声处理固定化木瓜蛋白酶,结果如图3所示。

图3 超声时间对固定化木瓜蛋白酶相对酶活力的影响Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on the relative enzyme activity of immobilized papain

由图3可知,随着超声时间的增大,相对酶活呈现先增大后减小的趋势,并在20 min处达到最大值,相对酶活为164.06%。Long[19]发现随着超声时间的增加,固定化酶提取亚麻籽油的能力先增加后趋于平缓,在9 h时酶活力达到最大值。王振斌等[20]实验表明淀粉酶的相对酶活力随超声时间的增大而先增加后减小,且最适时间为10 min,分析可能是因为随着超声时间的增加,有利于酶的空间结构改善、淀粉的溶解和淀粉与酶的有效接触几率的提高,而时间过长,会使淀粉酶空间结构遭到破坏,导致酶活性降低。

2.1.4 超声温度对固定化木瓜蛋白酶活力的影响 在不同的温度下超声处理固定化木瓜蛋白酶,结果如图4所示。

图4 超声温度对固定化木瓜蛋白酶相对酶活力的影响Fig.4 Effect of ultrasound treatment temperature on the relative enzyme activity of immobilized papain

由图4可知,随着超声温度的增大,相对酶活呈现先增大后减小的趋势,并在40 ℃处达到最大值,相对酶活为166.56%。Sneha等[21]发现固定化脂肪酶的活性随着超声温度的升高,呈现先升高后降低的趋势。石文奇等[22]发现α-淀粉酶酶活会随着超声温度的升高先升高后下降,与本研究结果相一致。林剑等[23]分析认为超声处理导致酶活力降低的原因为:超声温度过高可能会导致酶的失活和构象发生变化,从而使α-淀粉酶的酶活降低。

2.1.5 超声处理固定化木瓜蛋白酶催化活性的条件优化 采用偏最小二乘回归分析方法对混合水平均匀实验结果进行分析。实验结果如表2所示,得到最优超声条件为135 kHz,0.05 W/cm2,20 min,40 ℃,相对酶活是229.18%。在最优条件下进行验证实验,相对活力为221.25%,相对误差为3.58%。虽然N9、N11、N17、N19值比实测值大，但经过SPSS分析，该四组结果与实测值无显著性差异。对比预测值和实测值,可以说明建立的预测模型具有一定的实践指导意义。

表2 超声处理固定化木瓜蛋白酶条件优化的均匀实验结果Table 2 Uniform design matrix and corresponding results

2.2 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适条件的影响

2.2.1 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适pH的影响 由图5可知,非超声的固定化酶活力随着pH的升高,呈现出先增大再减小的趋势,在pH=6.5时酶活力达到最高为2.75 U/g;经超声处理后的固定化酶,酶活力也在pH=6.5处达到最高为3.30 U/g。由此可见,超声处理并未改变固定化酶的最适pH的水平和范围,但是可以提升固定化酶的活力。吴葛洋等[24]实验超声对固定化木瓜蛋白酶酶学特性的实验发现,超声只是提升了固定化酶的酶活,并未改变其最适pH,与本研究的结果相符合,分析认为超声处理固定化木瓜蛋白酶只对其产生物理作用,并未使其化学结构发生变化,故最适pH范围不会改变。

图5 超声处理对固定化酶最适pH的影响Fig.5 The effects of ultrasonic treatment on optimum pH of the immobilized enzyme

2.2.2 超声处理对固定化木瓜蛋白酶最适温度的影响 由图6可知,非超声的固定化酶活力随着温度的升高,呈现出先增大再减小的趋势,在60 ℃时酶活力达到最高为3.67 U/g;经超声处理后的固定化酶,酶活力也在60 ℃处到最高为2.82 U/g。由此可见,超声处理并未改变固定化酶的最适温度。苏二正等[25]经实验测得游离木瓜蛋白酶的最适温度50 ℃,发现固定化可以提高酶的最适温度,经测定固定化后最适温度会提升到60～70 ℃,与本研究的结果相吻合。同时温度对酶促反应具有两方面影响:温度升高可以促进酶与底物分子的运动,从而提高碰撞几率,提高酶活力,但是,温度继续升高,会使蛋白质分子会发生变性,导致酶活性中心结构的改变,阻碍酶促反应的效率。在60 ℃时非超声比超声后酶活大,分析可能是因为,超声的空化作用会使酶的结构发生变化,影响了酶的结构,从而使酶活有所降低。

图6 超声处理对固定化酶最适温度的影响Fig.6 The effects of ultrasonic treatment on optimum temperature of the immobilized enzyme

3 结论与讨论

通过单因素实验,研究超声频率、超声功率、超声时间、超声温度对固定化酶活性的影响。在单因素实验的基础上,通过均匀实验,确定最优超声条件为135 kHz、0.05 W/cm2、20 min,40 ℃,相对酶活力为229.18%。验证实验证明最优的超声条件下测得固定化木瓜蛋白酶的相对酶活力为221.25%,相对误差为3.58%,说明建立的预测模型具有一定的实践指导意义。改性明胶固定化木瓜蛋白酶的最适pH为6.5,最适温度为60 ℃,超声处理并未改变固定化酶的酶学特性。

超声处理固定化酶,可以改善固定化后酶活性降低等缺点。由于超声能够有效地提高酶的活力,从而改善食品的物理化学性质,这对提高食品的加工性能、贮藏性能以及营养功能等具有重要的意义,使得超声处理酶具有广阔的应用前景。超声对固定化酶的作用复杂,本文只实验了超声频率、超声功率、超声时间、超声温度的影响。但超声对于固定化酶作用机理及对酶催化选择性的探究等,有待于进一步实验。

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Effect of ultrasound treatment on the activity of immobilized papain prepared by modified gelatin

BAI Ge1,ZHENG De-juan1,ZHANG Jie1,CHEN Xue1,CAO Yan-ping1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China;2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,Beijing 100048,China)

Immobilized papain was prepared through modified gelatin with glutaraldehyde. The effects of power,frequency,time and temperature on the efficacy of ultrasound treatment to stimulate the activity of immobilized papain were investigated in this study. The optimal ultrasound treatment conditions were determined by uniform design and least square regression analysis to be 135 kHz,0.05 W/cm2,20 min and 40 ℃. The results of validation experiments showed an actual value of 221.25% with a relative error of 3.58% compared to thearetical value. The optimal temperature and the optimal pH were not influenced by ultrasonic treatment.

ultrasound;immobilized papain;enzyme activity

2016-05-27

白鸽(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：固定化酶，E-mail：baige821@163.com。

*通讯作者:曹雁平(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品化学与安全，E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31371722)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.013