如意草生物碱提取及抑菌活性研究

杨园园,史 娟,徐添鑫

(陕西理工大学化学与环境科学学院,陕西汉中 723000)

如意草生物碱提取及抑菌活性研究

杨园园,史 娟*,徐添鑫

(陕西理工大学化学与环境科学学院,陕西汉中 723000)

通过采用单因素及正交实验,以如意草中生物碱的光吸收值为指标进行检测,优化如意草生物碱的最佳提取工艺为:以乙醇为溶剂时,乙醇浓度75%,料液比1∶10,超声时间120 min,超声温度40 ℃。在此条件下,如意草生物碱提取率最高,达到1.656%。此外,研究了如意草生物碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌的抑菌活性,实验结果表明:如意草生物碱对四种供试菌种均有明显抑制作用,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌最低抑菌浓度分别为40、50、40、50 μg/mL。

如意草,生物碱,超声波提取,抑菌活性

如意草(CorydalistaliensisFr.)是罂粟科紫堇属植物,别名大理紫堇、断肠草、水黄连、水如意、五味草,主要分布于四川、贵州、云南等地。如意草味苦,性寒,归肺、肝经,具有祛风、清热、止痛和清肝明目等作用[1]。罂粟科植物富含生物碱,全世界有43个属,约700种,主要分布在北温带[2]。目前,如意草中已被鉴定有出含有七个生物碱[3],包括紫堇灵碱(corynoline)、原阿片碱(protopine)、乙酰紫堇灵(acetylcorynoline)、消旋紫堇灵(±)corynoline、必枯枯灵bicucline等,并被证实具有抗菌、镇静及保护肝脏损伤等多种活性作用[4]。现代研究发现,如意草中含有的生物碱成分,如原阿片碱、乙酰紫堇灵、紫堇灵碱等多具有广泛的药理活性[5],是许多中草药及药用植物的有效成分[6-8],具有消炎、抗菌[9]等多种特点。国外最新报道,紫堇灵生物碱在抗坏血病问题上有较大潜力,而乙酰紫堇灵通过抑制树突状细胞的功能有望成为提高免疫力的药剂之一[10-12]。生物碱常用的提取方法有水或偏酸性水溶液提取、醇提法[13]、亲脂有机溶剂提取法、超声波提取法[14]。

国内对如意草的研究报道较少,利用超声技术对如意草中生物碱类物质的提取还未见文献报道。超声波提取法能提高有效成分的溶出速度和溶出次数、缩短提取时间、节省溶剂的消耗、提取率高[15],本文采用超声波提取法提取如意草中的生物碱,同时对超声波提取工艺进行探讨,采用正交实验优选出最佳提取条件,为如意草生物碱的开发和利用提供客观的实验数据。

近年来,国内对如意草生物碱的抑菌作用还未见文献报道。为了更好地开发利用如意草资源,本文采用几种常用的抑菌方法(尹爱武[16]、何水平[17]等人在抑菌实验中的研究)对如意草生物碱对四种供试菌种的抑菌作用进行探索,为如意草生物碱的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

如意草 2014年10月份采自陕西省榆林山区,清洗去杂后置于烘箱内50 ℃下烘干至恒重,粉碎成60目后,装袋放置备用;盐酸小檗碱标准品 上海金穗生物科技有限公司;无水乙醇、溴甲酚绿、柠檬酸、柠檬酸钠、氯仿等试剂 均为分析纯;胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂粉 北京奥博星生物技术有限责任公司;革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis);革兰氏阴性菌:大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella) 陕西理工学院生物工程学院微生物实验室。

AL204-IC电子天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;Cary50型紫外可见分光光度计 美国瓦里安中国有限公司;DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;RE-2A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;FW100型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公;SW-CJ-IB型超净工作台 苏州净化设备有限公司;SHP-80型生化培养箱 上海森德实验仪器有限公司;LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SB3200DTDN超声波清洗机 宁波斯芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 盐酸小檗碱标准曲线的绘制 准确称取3.75 mg盐酸小檗碱标准品,溶于少量蒸馏水中定容至25 mL,配成150 mg/L的盐酸小檗碱标准溶液。准确吸取盐酸小檗碱标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL移入25 mL刻度比色管中,分别加入1 mL蒸馏水、2 mL溴甲酚绿缓冲溶液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制的0.04%溴甲酚绿溶液)、4 mL pH为5.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液及5 mL三氯甲烷,充分振荡摇均匀后静置1 h观察,以三氯甲烷做为参比,在414 nm处测定不同浓度盐酸小檗碱的吸光度,得到盐酸小檗碱浓度C(mg/mL)与吸光度A的回归方程。

1.2.2 如意草生物碱的提取方法 称取一定质量的如意草粉末,加入75%乙醇溶液作为溶剂浸泡12 h后,用超声波提取、抽滤,收集滤液,将滤液旋转蒸发浓缩得到浸膏,再用柠檬酸溶解浸膏,调其pH至2.5,再用无水Na2CO3调pH至10.5,即得到粗产物生物碱沉淀,离心后弃去上层清夜,在下层沉淀中加入10 mL乙醇溶解[18-21],在414 nm处测其吸光度并计算提取率。

如意草生物碱提取率(%)=(C×V×n)/m×100

其中,C为如意草生物碱浓度,V为提取体积,n为稀释倍数,m为原料质量。

1.2.3 如意草生物碱的单因素实验 以如意草生物碱的吸光值为指标,分别考察乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度4个因素对提取率的影响,每个因素设定5个梯度,进行单因素实验,各单因素实验重复3次,并取平均值。

1.2.3.1 乙醇浓度对生物碱提取率的影响 准确称取2 g如意草粉末5份,置于5个锥形瓶中,按1.2.2中的方法超声波提取,在料液比1∶25,超声时间120 min,超声温度70 ℃的条件下,改变乙醇浓度为55%、65%、75%、85%、95%,考察乙醇浓度对生物碱吸光度的影响。

1.2.3.2 料液比对生物碱提取率的影响 准确称取2 g如意草粉末5份,置于5个锥形瓶中,以85%乙醇为溶剂,固定超声温度70 ℃,超声时间120 min,改变料液比为1∶10、1∶20、1∶25、1∶35、1∶45,考察料液比对生物碱吸光度的影响。

1.2.3.3 超声时间对生物碱提取率的影响 准确称取2 g如意草粉末5份,置于5个锥形瓶中,以85%乙醇为溶剂,固定料液比1∶20,超声温度70 ℃,改变超声时间为60、90、120、150、180 min,考察超声时间对生物碱吸光度的影响。

1.2.3.4 超声温度对生物碱提取率的影响 准确称取2 g如意草粉末5份,置于5个锥形瓶中,以85%乙醇为溶剂,固定料液比1∶20,超声时间120 min,改变超声温度为40、50、60、70、80 ℃,考察超声温度对生物碱吸光度的影响。

1.2.4 如意草生物碱的正交实验 在单因素实验的基础上,以乙醇浓度、超声温度、超声时间和料液比为因素,设计L9(34)实验以确定如意草生物碱提取的最佳工艺条件,各因素水平的设定如表1所示。

表1 L9(34)正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiments

1.2.5 如意草生物碱抑菌活性实验

1.2.5.1 如意草生物碱的制备 取如意草粉末5 g,加入50 mL 75%乙醇,超声时间120 min、超声温度40 ℃,此时如意草生物碱的浓度为100 mg/mL,将得到的如意草生物碱取100 μL用无菌水稀释配制成浓度分别为0.05、0.2、0.3、0.8、1.07 mg/mL的如意草生物碱浓度溶液,此时乙醇的体积在溶液中含量不足百分之一可以忽略其对抑菌的影响。

1.2.5.2 菌悬液的制备 在超净工作台中,将四种供试菌种用接种环挑取单个菌落分别接种于LB液体培养基中,于37 ℃在摇床上振荡培养24 h进行菌种活化,挑取活化的菌种于平板LB固体培养基中进行菌种分离纯化(防止实验过程中的交叉感染应定期纯化菌种,使实验更加准确可靠),用接种环挑取单个菌落再次接种于LB液体培养基中,对纯化的菌液进行活菌计数,最后将菌液稀释配制成含菌量106cfu/mL的菌悬液,备用。

1.2.5.3 牛津杯法测定如意草生物碱抑菌效果 将已干燥灭菌的不锈钢牛津杯(内孔直径为6 mm)用无菌镊子夹取平放在含菌平板上,每个含菌平板上呈“品”字形放置3个牛津杯,分别在每个牛津杯中加入200 μL(浓度为1.07、0.8、0.3、0.2、0.05 mg/mL)的如意草生物碱,无菌水做对照,每个浓度做3个重复。将平板置于37 ℃下培养24 h,取出后测量牛津杯抑菌圈直径,每组测定6次取其平均值。

1.2.5.4 如意草生物碱最低抑菌浓度(MIC)测定 参考微量肉汤稀释法[22-23],对如意草生物碱进行MIC的测定。将如意草生物碱样品溶解在无菌水中,配制成样品质量浓度为1 mg/mL,经计算,得到系列如意草生物碱质量浓度为:30、40、50、60、70 μg/mL。实验组每支试管加入20 μL菌液及一定体积的LB液体培养基和一定体积的样品(表2),对照组只加20 μL菌液100 μL无菌水和100 μL的LB液体培养基。将试管置于37 ℃的摇床上振荡培养16～18 h,取出,观察试管中液体的浑浊情况。液体澄清的为无菌生长,浑浊的为有菌生长。以第几号试管以下不再发生明显浑浊现象,这一试管的浓度即为该细菌的最低抑菌浓度(MIC)。

表2 如意草生物碱的试管实验Table 2 Test on alkaloids of Corydalis taliensis Fr.

1.3 数据分析

实验数据均为3次重复,取平均值,数据分析采用Origin8.5软件。

2 结果与分析

2.1 盐酸小檗碱标准曲线

以盐酸小檗碱浓度C(mg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,得到标准曲线回归方程式为:A=2.18452C-0.38939,R2=0.99326,表明盐酸小檗碱的浓度(mg/mL)与吸光度有良好的线性关系,可将其用于提取率的测定中。

2.2 单因素实验结果

2.1.1 最佳乙醇浓度的选择 以吸光值为指标,如意草生物碱的吸光度越大提取率就越高。如图1所示,在乙醇浓度为55%～85%内,随着乙醇浓度的增大,如意草生物碱的吸光度逐渐增大,这是因为生物碱类物质较易溶于乙醇,乙醇浓度越大,如意草生物碱的溶出效果越好。当乙醇浓度为85%时,如意草生物碱测得的吸光度最大。但当乙醇浓度过高时,吸光度下降,可能是因为乙醇浓度过高,其它一些醇溶性杂质溶出也增多,影响了如意草生物碱的溶出。因此提取如意草生物碱时,选择乙醇浓度为85%最佳。

图1 不同乙醇浓度的提取效果Fig.1 Results of different ethanol concentration

2.1.2 最佳料液比的选择 从图2可知,如意草生物碱的吸光度随着料液比增加先是大幅度升高,然后逐渐呈现不同幅度的下降,料液比在1∶20时,如意草生物碱的吸光度达到最大值,之后随料液比的增大而不断降低,这是由于在一定范围内增加提取剂用量过大反而不利于如意草生物碱的溶出,从而造成影响提取效果;而溶剂过多则会吸收超声波辐射能力,因而影响生物碱的溶出,从而影响产率。故选择料液比1∶20最佳。

图2 不同料液比的提取效果Fig.2 Results of different material/liquid ratio

2.1.3 最佳超声时间的选择 从图3可以看出,在一定范围内,如意草生物碱的吸光度随超声时间的延长而不断提高,但当超声时间超过120 min后,提取率逐渐变小,这可能是因为较长时间的超声处理影响了部分如意草生物碱的组成及结构,并且随着时间的延长,溶剂挥发也越多,进一步影响提取率。故选择120 min为最佳超声时间。

图3 不同超声时间的提取效果Fig.3 Extraction effect of different ultrasonic time

2.1.4 最佳超声温度的选择 从图4可以看出,超声温度为40～50 ℃时,如意草生物碱的吸光度随温度的升高而增大,温度高于50 ℃时,吸光度下降。这是由于温度过高,溶剂挥发损失,导致生物碱提取不完全,也可能会破坏如意草中的一些成分结构。因此,选择50 ℃为最佳超声温度。

图4 不同超声温度的提取效果Fig.4 Extraction effect of different ultrasonic temperature

2.2 正交实验结果

2.2.1 正交实验结果 由表3可知,各因素对如意草生物碱吸光度的影响大小是D>C>B>A,即超声温度>超声时间>料液比>乙醇浓度。如意草生物碱的最佳提取工艺条件是A1B1C2D1,即乙醇浓度为75%,料液比为1∶10,超声时间为120 min,超声温度为40 ℃。由表4方差分析结果可知,F比

表5 不同浓度的如意草生物碱的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of different concentration on alkaloids of Corydalis taliensis Fr.

注:6.00 mm(牛津杯内径),表示未观察到明显抑菌圈。

表3 正交实验结果Table 3 Orthogonal test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 验证性实验 为了进一步考察上述优选工艺的稳定性,按上述最佳条件:乙醇浓度为75%,料液比为1∶10,超声时间为120 min,超声温度为40 ℃,进行三次平行实验。用紫外可见分光光度计测定其吸光度值为5.641,并计算出如意草生物碱的提取率,得到的平均提取率为1.656%。

2.3 牛津杯法测定如意草生物碱的抑菌活性

2.3.1 如意草生物碱的抑菌效果 以牛津杯法测定的抑菌圈直径为指标,评价如意草生物碱对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏菌的抑菌效果[24]:无抑菌圈者为抑菌效果不明显、抑菌圈直径7～9 mm为低度抑菌、抑菌圈直径10～15 mm为中度抑菌、抑菌圈直径>15 mm为高度抑菌。如意草生物碱对四种供试菌种的抑菌效果见表5,由表5可知如意草生物碱对2种具有致密细胞壁的革兰氏阳性菌和2种细胞壁较疏松的革兰氏阴性菌都有不同程度的抑菌作用,具有抑菌活性。此外,如意草生物碱对枯草芽孢杆菌的抑制效果最强,对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑制作用相当,对沙门氏菌的抑制能力较差。随着提取物浓度的增大,其抑菌活性逐渐增强。由此可见,如意草生物碱具有一定的抑菌能力。

2.3.2 如意草生物碱最低抑菌浓度(MIC)的测定 如意草生物碱对四种细菌的最低抑菌浓度如表6所示,由表6中可知,如意草生物碱对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌浓度各不相同,最低抑菌浓度(MIC)分别40、40、50、50 μg/mL。随着如意草生物碱浓度增大,抑菌活性也在逐渐增强。如意草生物碱对四种菌抑制能力最强的是大肠杆菌和沙门氏菌,其总的抑菌活性顺序:大肠杆菌=沙门氏菌<金黄色葡萄球菌=枯草芽孢杆菌。

表6 如意草生物碱对供试菌种的最低抑菌浓度(MIC)Table 6 Minimal inhibitory concentration(MIC)of alkaloids of Corydalis taliensis Fr.different strains

注:-表示无菌生长;+表示菌生长少;++表示菌生长较多;+++表示菌生长多。3 结论

3.1 本实验采用超声波法对如意草生物碱进行了提取,在单因素实验的基础上采用正交实验对提取工艺进行优化,得到如意草生物碱的最佳提取工艺是:乙醇浓度75%,料液比1∶10,超声时间120 min,超声温度40 ℃,该条件下如意草生物碱的提取率为1.656%。

3.2 如意草生物碱的抑菌实验结果表明,不同浓度的如意草生物碱对供试的4种细菌,呈现不同的抑制作用。其中,1.07 mg/mL的生物碱对枯草芽孢杆菌的抑制能力最强,其次为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,沙门氏菌的抑菌效果最弱;其中枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC为40 μg/mL,大肠杆菌和沙门氏菌的MIC为50 μg/mL。本实验表明,用超声波提取如意草生物碱的方法可行,具有提取率较高、时间短、温度低等特点,以乙醇为介质对如意草生物碱进行超声波处理,有利于生物碱的提取。另外,此生物碱具有较明显的抑菌活性,从资源利用的角度来看,如意草也具有较大的开发潜力。

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Extraction and antibacterial activity of alkaloidsfrom theCorydalistaliensisFr.

YANG Yuan-yuan,SHI Juan*,XU Tian-xin

(Chemistry and Environmental Science,Dept.,Shaanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723000,China)

To select the basicextracting way of alkaloid from theCorydalistaliensisFr. with ultrasonic,the best one was selected with absorbency of alkaloid as index by single factor test and orthogonal test. The results showed the optimum extraction conditions were as follow:the concentration of ethanol 75%,material to liquid ratio was 1∶10,ultrasonic time was 120 min and ultrasonic temperature was 40 ℃.The alkaloidsextraction yield could reach 1.656% in the optimum conditions. In addition to,the antibacterial activities of alkaloidCorydalistaliensisFr. was determined. The minimum inhibitory concentration(MIC)ofCorydalistaliensisFr. alkaloidon Staphylococcus aureus,Escherichiacoli,BacillussubtilisandSalmonellatyphimuriumwas 40,50,40,50 μg/mL,respectively.

CorydalistaliensisFr. ;alkaloids;ultrasonic extraction;antibacterial activity

2016-06-28

杨园园(1995-)，女，大学本科，研究方向：天然产物的研究开发，E-mail：yangyuanyuan910@126.com。

*通讯作者:史娟(1978-),女，博士，研究方向：天然产物化学和有机合成，E-mail:446269824@qq.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)02-0277-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.045