贯叶连翘花中挥发油的提取工艺优选及抑菌活性研究

王 燕,张志琪,徐红颖,张 爽,王飞娟,苏文香

(1.陕西国际商贸学院,陕西咸阳 712046;2.陕西师范大学化学化工学院,药用资源与天然药物化学教育部重点实验室,陕西西安 710062;3.内蒙古化工职业学院,内蒙古呼和浩特 010070)

贯叶连翘花中挥发油的提取工艺优选及抑菌活性研究

王 燕1,张志琪2,徐红颖3,张 爽1,王飞娟1,苏文香1

(1.陕西国际商贸学院,陕西咸阳 712046;2.陕西师范大学化学化工学院,药用资源与天然药物化学教育部重点实验室,陕西西安 710062;3.内蒙古化工职业学院,内蒙古呼和浩特 010070)

采用水蒸气蒸馏法对贯叶连翘花中挥发油进行提取,以挥发油提取率为响应值,通过单因素实验对影响提取工艺的参数(浸泡时间、提取时间和料液比)进行考察,并利用三因素三水平响应曲面实验法确定了贯叶连翘花中挥发油的最优提取工艺,即浸泡时间19 h,液固比9∶1 mL/g,提取时间10 h,该条件下贯叶连翘花中挥发油的提取率为1.03 mL/100 g,与理论值1.10 mL/100 g仅相差2.73%。同时测试了该挥发油的抑菌活性,其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为9、10、12 mm,表明贯叶连翘花中挥发油有一定的抑菌活性。

贯叶连翘花,挥发油,水蒸气蒸馏提取法,响应曲面法,抑菌活性

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)为藤黄科金丝桃属多年生草本植物,药用历史达两千年之久,具有清热利湿、疏肝解郁、抑菌止血等功效[1-2]。贯叶连翘含有多种活性成分如蒽醌类和黄酮类等,在抗抑郁、镇痛、抗氧化等方面具有广谱的药理活性,研究亦表明金丝桃属植物中挥发油均具有明显的抗菌作用[3-4],因此贯叶连翘的抑菌等活性疑与含有的挥发油成分相关。

关于挥发油的提取、分析及应用已成为研究热点[5],目前已有关于贯叶连翘全草和地上部分挥发油的化学成分和药理作用研究,且不同方法和不同药源挥发油的提取效率、化学组成、含量和药效等有所差异[6-7]。贯叶连翘花中含有丰富的挥发油,而关于花中挥发油的提取与抑菌活性研究还尚未见报道。

水蒸气蒸馏法具有操作简单、节约成本、产品纯度高及无有机溶剂残留等特点[8-9],广泛用于挥发油的提取研究。本研究拟采用该方法对贯叶连翘花中挥发油进行提取,结合响应面实验法对工艺过程进行优化,以提高产率;同时对贯叶连翘花中挥发油抑菌活性进行研究,为贯叶连翘花资源在日用、食品、医药、化工等领域的开发提供有力的理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贯叶连翘花 购自陕西汉中勉县,经陕西国际商贸学院生药学教研室雷国莲教授鉴定,清洗后晾干、粉碎至40目,避光阴凉处保存,备用;无水乙醚和无水硫酸钠等 均为国产分析纯;LB培养基 蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 10 g,加水至1000 mL,固体培养基加入琼脂粉20 g,于121 ℃灭菌20 min。

9FZ-15B型多用粉碎机 富强机械制造有限公司;DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器 陕西泰康生物科技有限公司;FA2204B型电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司;YXQ-LS-50S型立式压力蒸汽灭菌锅 上海讯博实业有限医疗公司。

1.2 实验方法

1.2.1 挥发油的提取方法 称取20 g粉碎的贯叶连翘花于合适的圆底烧瓶中,加入一定量的蒸馏水密封,浸泡一定时间后,连接挥发油提取器和冷凝管,置于集热式恒温磁力搅拌器上,于125 ℃油浴加热一定时间。挥发油提取完全后,以无水乙醚收集挥发油,并加入少量无水硫酸钠(以不结晶为宜),蒸发乙醚可得到一定量亮黄色油状液体，挥发油提取得率计算如下:

R=V/m×100

式中，R为挥发油提取得率,mL/100 g;V:挥发油体积,mL;m:药材质量,g。

1.2.2 挥发油提取的单因素实验

1.2.2.1 浸泡时间的影响 按照1.2.1挥发油提取方法,当液固比为10∶1 mL/g,提取时间为12 h的条件下,研究不同浸泡时间(6、10、14、18、22、26 h)对贯叶连翘花中挥发油提取率的影响。

1.2.2.2 液固比的影响 按照1.2.1挥发油提取方法,当浸泡时间为18 h,提取时间为12 h的条件下,研究不同液固比(4∶1、7∶1、10∶1、13∶1、16∶1、19∶1 mL/g)对贯叶连翘花中挥发油提取率的影响。

1.2.2.3 提取时间的影响 按照1.2.1挥发油提取方法,当浸泡时间为18 h,液固比为10∶1 mL/g的条件下,研究不同提取时间(3、6、9、12、15、18 h)对贯叶连翘花中挥发油提取率的影响。

1.2.3 响应曲面实验优化 在单因素实验基础上,选取浸泡时间(A)、液固比(B)和提取时间(C)三个因素为影响挥发油提取率的主要因素,以-1、0和1分别表示因素的高中低三个水平。按照响应曲面实验方法(RSM)进行因素水平安排和实验设计,见表1。

表1 响应曲面实验设计与因素水平Table 1 Variables and levels of RSM

1.2.4 挥发油抑菌活性研究 采用滤纸片法初步测定水蒸气蒸馏法提取的贯叶连翘花的挥发油对不同菌种(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)的活性,即将菌种接种到液体培养基中振荡培养,至对数生长期时进行计数。取100 μL菌悬液于9 cm平板上涂布均匀,向平板中央打3 mm的孔,向孔内滴加5 μL挥发油,对照板加5 μL灭菌水,置于培养箱中(37 ℃,24 h)。观察菌种的生长情况并进行数据的记录,测量抑菌圈的直径,重复3次[10]。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0软件对数据进行分析,实验结果以平均值±标准误差(mean±SE)进行表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 浸泡时间对贯叶连翘花挥发油提取率的影响 考察浸泡时间对贯叶连翘花中挥发油提取率的影响,结果见图1。当浸泡时间低于10 h时,挥发油提取率相对较低;随着浸泡时间延长至18 h时,挥发油提取率呈现明显上升趋势;随后随着时间的增加,挥发油提取率呈现下降趋势。原因可能是刚开始时,药材组织细胞尚未充分膨胀,当浸泡时间达18 h时,药材组织细胞膨胀,加速了细胞内外物质交换的速率,促进了挥发油的提取。挥发油得率下降的原因,也可能与实验过程温度较高和实验季节的环境温度偏高,挥发油分子运动速率加快易于散失到空气中相关。因而选18 h为合适的浸泡时间。

图1 浸泡时间对挥发油提取率的影响Fig.1 Effect of soaking time on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil

2.1.2 液固比对贯叶连翘花挥发油提取率的影响 由图2可知,随着液固比的增加,挥发油提取率增大,液固比为10∶1 mL/g时提取率最大;当继续增加液固比,挥发油提取率出现明显下降的趋势,即溶剂(水量)的变化对挥发油提取率有一定影响。原因可能为水量少不能充分浸泡药材原料,随着水量的增加,药材与水充分接触,提取率增加;但当加水量过多,加热时溶液沸腾原料和挥发油沾壁,影响提取效果。因此,最适液固比选为10∶1 mL/g。

图2 液固比对挥发油提取率的影响Fig.2 Effect of solvent to material ratio on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil

2.1.3 提取时间对贯叶连翘花挥发油提取率的影响 从图3可以看出,当提取时间为3～9 h时,贯叶连翘花中挥发油的提取率出现快速增加的趋势,9 h时提取率达到最大值,这与提取刚刚开始时,由于溶剂与物料中挥发油浓度不同导致的扩散驱动力增大有关;当继续延长提取时间,提取率的变化趋势较为平缓,即挥发油基本提取完全,这可能与提取贯叶连翘花中挥发油的过程,溶液体系达到了动态平衡而致挥发油提取率变化不大有关。说明9 h是理想的挥发油提取时间。

图3 提取时间对挥发油提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of Hypericum perforatum L. flowers volatile oil

2.2 响应曲面优化实验结果与分析

2.2.1 二次回归模型方程的建立及方差分析 以贯叶连翘花中挥发油的提取率为考察指标,在单因素实验基础上,对浸泡时间、液固比和提取时间等三个因素按照响应曲面法三因素三水平,五个中心点的方法,即十七个实验点的实验设计及结果,见表2。

经过拟合的三元二次回归方程为:

Y=-2.61125+0.093750A+0.14425B+0.42792C+1.25000E-003 AB+4.30556E-003AC-6.66667E-004BC-3.95833E-003A2-8.20000E-003B2-0.026667C2

二次方程回归模型的方差分析结果见表3。

表2 贯叶连翘花中挥发油提取工艺响应曲面优化实验结果Table 2 RSM design arrangement and corresponding of volatile oil yield

2.2.2 响应曲面优化结果与分析 根据模型方程绘制的响应曲面图与标准残差曲线等,结果见图4。图4为影响贯叶连翘花中挥发油提取率的因素之间交互作用的关系图,可直观的反映出因素交互作用对提取率的影响大小。图4a中浸泡时间的曲线较为平缓,表明浸泡时间对提取率的影响较弱,液固比较浸泡时间对提取率的影响较强,呈现先上升后减小的趋势,等高线图反映出浸泡时间与液固比交互作用对提取率的影响较为显著,与方差分析结果一致。图4b中浸泡时间的曲线仍比较平缓,但随着提取时间的增加提取率呈现大幅度增加,浸泡时间和提取时间的交互作用极为显著。图4c中,仅液固比对提取率的影响极为显著,提取时间和交互作用对提取率无显著性影响。从图4可获得因素的合理水平范围为:浸泡时间16～19 h;液固比8∶1～12∶1 mL/g;提取时间8～10 h。

表3 响应曲面实验拟合方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

注:**表示差异性极显著(p<0.01);*表示差异性较为显著(p<0.05)。

求导得到响应曲面法优化贯叶连翘挥发油提取工艺的条件为:浸泡时间18.50 h,液固比9.39∶1 mL/g,提取时间9.83 h,由于实际操作条件的限制,故将参数修订为浸泡时间19 h,液固比9∶1 mL/g,提取时间10 h,该条件下贯叶连翘花中挥发油提取率达1.03 mL/100 g,与理论值1.10 mL/100 g仅相差2.73%。

2.3 挥发油的抑菌活性研究

抑菌实验发现,加入贯叶连翘花中挥发油的平板上形成了抑菌圈,其直径大小见表4所示,即该挥发油对供试菌种:金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有一定的抑制活性,其抑菌活性大小顺序为枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。

表4 贯叶连翘花中挥发油对菌种的抑菌圈直径Table 4 Antimicrobial cycle diameter of volatile oil from Hypericum perforatum L. flowers

3 结论

本研究采用响应曲面优化法对水蒸气蒸馏法提取贯叶连翘花中挥发油的工艺进行优化,确定的最佳工艺条件为:浸泡时间19 h,液固比9∶1 mL/g,提取时间10 h,该条件下挥发油的提取率为1.03 mL/100 g,与理论值1.10 mL/100 g较为接近,则响应曲面实验模型可用于贯叶连翘花中挥发油的提取。贯叶连翘花中挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌实验测试中,其对应的抑菌圈直径分别为9、10、12 mm,即该挥发油对供试菌有一定的抑制作用,这与挥发油中化合物含有的羟基和不饱和键的存在有关。

贯叶连翘花中挥发油具有潜在的抑菌活性,与挥发油中多成分协同、多靶点作用的有关。进一步对贯叶连翘花中挥发油成分进行分析和鉴定,成为本课题组下阶段研究目标。

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Extraction and antibacterial activity of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers

WANG Yan1,ZHANG Zhi-qi2,XU Hong-ying3,ZHANG Shuang1,WANG Fei-juan1,SU Wen-xiang1

(1.Shaanxi Institute of International Trade&Commerce,Xianyang 712046,China;2.Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry,Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China;3.Inner Mongolia Vocational College of Chemical Engineering,Hohhot 010070,China)

To study steam distillation extraction technology of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers,the type of parameters soaking time,solvent to solid sample ratio and extraction time were investigated in single factor experiments with extraction yield of volatile oil as evaluation index. The best extraction processes were obtained with three factors and three levels of response surface methodology as follows:soaking time 19 h,solvent to solid sample ratio 9∶1 mL/g and extraction time 10 h respectively,leading to an extraction yield of volatile oil 1.03 mL/100 g,and the experimental value are basically close to the theoretical expectation value 1.10 mL/100 g,with only 2.73% deviation. Combining with the antibacterial activity tests,the antimicrobial cycle diameter of volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers were 9,10,12 mm forEscherichiacoli,StaphyloccocusaureusandBacillussubtilis,which suggested volatile oil fromHypericumperforatumL. flowers has a certain antibacterial effect.

HypericumperforatumL. flowers;volatile oil;steam distillation;response surface method;antibacterial activity

2016-04-18

王燕(1982-)，女，硕士研究生，讲师，主要从事天然药物有效成分方面的研究，E-mail:370749824@qq.com。

陕西省中医药管理局中医药科学技术研究项目(15ZY034)；陕西国际商贸学院校级课题(SMXY201631)；陕西省教育厅项目(16JK2031)；陕西省级大学生创新创业训练计划项目(2516)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)02-0273-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.044