蛋白质组学在胃癌生物学标记物研究中的应用

兰庆芝 马静静 董卫国

武汉大学人民医院消化内科(430060)

蛋白质组学在胃癌生物学标记物研究中的应用

兰庆芝*马静静 董卫国#

武汉大学人民医院消化内科(430060)

胃癌是消化道常见恶性肿瘤，早期诊断和早期治疗是改善患者预后的关键。近年来，应用蛋白质组学技术，通过分析、比较胃癌中异常表达的蛋白质，已发现一系列与胃癌发生、发展相关的蛋白，这些蛋白有潜力成为胃癌早期诊断和患者预后预测的生物学标记物。本文对近年来胃癌相关蛋白质组学生物学标记物的研究进展作一综述。

胃肿瘤； 蛋白质组学； 生物学标记； 诊断； 预后

胃癌是消化道常见恶性肿瘤，由于早期胃癌缺乏典型症状，多数患者确诊时已处于中晚期，这也是尽管近几十年来胃癌的治疗手段有了革命性的进展，但患者预后仍不理想的主要原因。早期诊断和早期治疗是改善胃癌患者预后的关键。内镜活检病理检查是目前胃癌早期诊断的主要方法，但内镜检查具有侵入性，对诊断技术的要求亦较高。因此，寻找可应用于临床的血清生物学标记物对于提高胃癌早期诊断率，进而改善患者预后具有重要意义。

蛋白质组(proteome)的概念最早由Marc Wilkins提出，是指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质[1]。近20年来，作为一种高通量、高灵敏度的技术，蛋白质组学(proteomics)已被广泛应用于各种恶性肿瘤的临床研究。应用蛋白质组学技术，通过分析、比较胃癌中异常表达的蛋白质，已发现一系列与胃癌发生、发展相关的蛋白，这些蛋白有望经进一步研究成为胃癌早期诊断和患者预后预测的生物学标记物。本文对常用蛋白质组学技术以及近年来胃癌相关蛋白质组学生物学标记物的研究进展作一综述。

一、蛋白质组学主要研究技术

1. 双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)：2-DE技术问世至今已有30余年，其原理是将蛋白质按不同等电点和相对分子质量进行分离，电泳后根据蛋白质上样量对胶进行考马斯亮蓝染色、银染色或荧光染色，然后使用相关软件对电泳图像进行分析。较之问世之初，目前2-DE的分辨率、灵敏度和可重复性都有了很大的改善。然而该技术仍存在下述问题亟待解决：①微量蛋白的鉴定；②极酸或极碱蛋白的分离；③极大蛋白(>200 kDa, 1 Da=0.992 1 u)或极小蛋白(< 10 kDa)的分离；④难溶蛋白的检测。此外，2-DE尚有不能完全自动化、操作耗时长等缺点。

2. 双向差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)：2D-DIGE是一项在2-DE基础上发展而来的新技术，与经典2-DE相比具有更高的动力学范围和灵敏度。该技术可将3种以不同荧光染料标记的蛋白样品在同一块凝胶上进行双向电泳，通过测定激发不同荧光染料所得到的荧光强度，比较蛋白表达水平的差异。由于是同时在同一块胶上进行3种蛋白样品分析，减少了跑胶次数以及不同胶上蛋白点阵的变异，使检测结果更为准确，既节省时间，又提高了可重复性，有取代传统2-DE的趋势。2D-DIGE的缺点主要在于分析通量低。

3. 表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spec-trometry, SELDI-TOF-MS)：SELDI-TOF-MS是新近兴起的一项全新的蛋白质组学技术，包括蛋白质芯片、飞行时间质谱和智能分析软件三部分。该技术的工作原理是基于蛋白质芯片的特异性吸附作用，利用激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成带电离子，离子在真空场中飞行的时间因质荷比不同而异，以此为基础绘制质谱图，最后经软件分析即可得到蛋白质相关信息。SELDI-TOF-MS具有简单、快速、高通量、高灵敏度等优点，可对样品中的蛋白质进行全景式分析，已被广泛应用于肿瘤标记物的筛查等研究。

二、胃癌相关蛋白质组学生物学标记物

1. 电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC1)：Schein等[2]于 1976年率先将源自草履虫线粒体的具有电压依赖性和阴离子选择性的蛋白嵌入脂质双层膜，并将该蛋白命名为VDAC。VDAC是相对分子质量为31 kDa的孔道蛋白， 存在于所有真核生物的线粒体外膜上，是线粒体与胞质间分子交换的通道，并参与调控线粒体途径的细胞凋亡[3]。VDAC有3种亚型，分别为VDAC1、VDAC2和VDAC3，三者氨基酸序列高度相似。VDAC各亚型在大部分组织中均能检测到，只是数量上存在差异。

Gao等[4]于2015年首次报导了VDAC1与胃癌的关系。该研究联合应用串联质谱标签(tandem mass tag)和质谱分析定量比较非癌与胃癌组织线粒体蛋白的丰度差异，结果显示VDAC1在胃癌组织线粒体中的表达量是毗邻非癌组织的1.77倍，同时证实临床胃癌组织中亦存在VDAC1表达异常，指出VDAC1是一个有应用前景的胃癌生物学标记物。

2. 血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A, SAA)：SAA是一种主要由肝脏合成、分泌的急性时相蛋白，正常情况下在机体内表达水平不高，在创伤、炎症、肿瘤状态下则可明显升高[5]。蛋白质组学研究发现SAA可能作为肾癌[6]、神经母细胞瘤[7]等恶性肿瘤的血清生物学标记物。

Chan等[8]采用2-DE和质谱分析比较了96例胃癌患者根治性胃切除术前后以及32例胃溃疡患者和52例健康体检者的SAA水平，发现胃癌患者SAA水平显著高于健康体检者和胃溃疡患者，并与肿瘤分期和部位相关。多变量分析显示SAA水平与肿瘤部位和有无淋巴结转移相关。术后随访中，胃癌复发者的SAA水平显著升高，未复发者则无明显变化。生存分析显示，SAA>97 mg/L的患者死亡风险增加4倍。上述发现提示SAA可用于胃癌患者的预后预测和术后随访中肿瘤复发的监测。我国学者采用免疫分析方法对SAA在胃癌患者中的临床意义进行了探讨，亦发现胃癌患者SAA水平显著升高，并与肿瘤大小、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征和术后复发相关，可作为胃癌侵袭、转移、复发和预后评估的生物学标记物[9-10]。

Wang等[11]对中国216例胃腺癌患者和333例健康志愿者的血清标本行液相蛋白芯片多重检测，结果显示胃癌患者SAA水平较健康志愿者高3.7倍，进一步的分析发现有远处转移的胃癌患者SAA水平显著高于未发生远处转移者，未转移者与健康志愿者之间则无明显差异。ROC曲线分析显示，SAA水平诊断转移性胃腺癌具有较高的准确性(AUC=0.834)。

3. 葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)：GRP78是由内质网合成的一种内质网分子伴侣，参与蛋白质的折叠和组装，同时也是一种应激蛋白，在低氧、低钙等应激状态下大量表达以维持细胞内环境稳定。已有大量研究表明，GRP78在某些肿瘤细胞中过表达，并与这些肿瘤的发生、发展以及化疗敏感性有关。

Wu等[12]的研究纳入胃癌患者的手术标本，采用2D-DIGE分析胃癌组织及其配对正常组织间的差异表达蛋白，并以蛋白质印迹法和免疫组化法进行验证。实验结果显示，包括GRP78在内的5个蛋白有望成为胃癌相关生物学标记物。蛋白质印迹法检测证实GRP78在胃癌组织中表达显著上调，并与肿瘤分期有相关趋势。免疫组化法检测则显示GRP78仅表达于胃腺癌细胞，正常组织中未见其表达。杨磊等[13]关于GRP78在胃癌中表达及其临床意义的免疫组化研究亦表明，GRP78在胃癌组织中的阳性表达率与肿瘤浸润深度、组织学分级、TNM分期和淋巴结转移显著相关，其高表达与胃癌细胞化疗耐药有关，多因素分析显示GRP78表达是胃癌患者无病生存期的独立影响因素，由此认为GRP78可作为评估胃癌恶性程度和化疗敏感性的分子标记物，用于指导化疗和判断预后。蛋白质间相互作用分析显示，KIAA1324可与GRP78结合，通过抑制GRP78与caspase-7的相互作用以及GRP78介导的AKT活化而诱导细胞凋亡，从而阻断GRP78的致癌活性[14]。

4. α-烯醇化酶(α-enolase, ENO1)：ENO1属于烯醇化酶家族成员，其功能为在糖酵解中催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸转化，是糖酵解过程中的限速酶。ENO1在某些恶性肿瘤中高表达可加速糖酵解过程，为肿瘤细胞提供快速增殖所需的能量，从而参与促进肿瘤发生、发展。

蛋白质组学研究发现，ENO1在cagA阳性幽门螺杆菌(Hp)感染的胃上皮细胞中的表达较cagA基因敲除Hp感染细胞明显上调；进一步的分析显示CagA蛋白系通过激活Src和MEK/ERK信号通路上调ENO1表达[15]。上述发现为Hp相关胃癌发病机制的研究提供了新线索，亦表明ENO1可能作为cagA阳性Hp相关胃癌的分子标记物。关于胃癌患者ENO1表达及其临床意义的免疫组化研究[16]显示，胃癌组织中的ENO1阳性表达率显著高于胃溃疡组织(67.3%对30.4%)，并与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期相关，是胃癌患者预后判断和治疗监测的潜在生物学标记物。胃癌细胞转染携带ENO1基因的真核表达载体后，增殖活力、克隆形成能力和迁移能力均显著增强，亦表明ENO1可作为胃癌发生、发展的生物学标记物[17]。

5. 丝氨酸蛋白酶抑制剂A1(Serpin peptidase inhibitor clade A member 1, SERPINA1)：SERPINA1又名α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin)，该蛋白分布广泛，在人体组织和血液中有较高的含量和较强的稳定性，众多研究显示其可能与多种肿瘤的发病有关。

Yang等[18]的研究选取70例胃癌患者和72例健康志愿者，采用磁珠纯化联合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术筛选可能的胃癌血清学标记物，发现SERPINA1和ENOSF1在胃癌患者中呈特异性高表达。Kwon等[19]的研究发现，SERPINA1过表达可促进胃癌细胞侵袭和迁移，其在胃癌组织中表达增强与肿瘤大小、浸润深度、神经和淋巴血管侵袭、淋巴结转移以及预后不良呈显著正相关，可能作为预测胃癌患者预后的生物学标记物。

三、结语与展望

蛋白质组学在发现和检测肿瘤生物学标记物方面具有不可替代的优势，有望成为胃镜活检之外早期发现胃癌的辅助手段，然而目前临床实践中仍缺乏敏感性和特异性均较理想的胃癌生物学标记物。尽管已有一些研究表明某些蛋白与胃癌的发生、发展和预后显著相关，但仍需开展多中心大样本临床试验加以验证，方可广泛应用于临床。

1 Wilkins MR, Sanchez JC, Gooley AA, et al. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J]. Biotechnol Genet Eng Rev, 1996, 13: 19-50.

2 Schein SJ, Colombini M, Finkelstein A. Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion-selective channel obtained from paramecium mitochondria[J]. J Membr Biol, 1976, 30 (2): 99-120.

3 Shoshan-Barmatz V, Ben-Hail D. VDAC, a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J]. Mitochondrion, 2012, 12 (1): 24-34.

4 Gao W, Xua J, Wang F, et al. Mitochondrial Proteomics Approach Reveals Voltage-Dependent Anion Channel 1 (VDAC1) as a Potential Biomarker of Gastric Cancer[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 37 (6): 2339-2354.

5 Uhlar CM, Whitehead AS. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant[J]. Eur J Biochem, 1999, 265 (2): 501-523.

6 Tolson J, Bogumil R, Brunst E, et al. Serum protein profiling by SELDI mass spectrometry: detection of multiple variants of serum amyloid alpha in renal cancer patients[J]. Lab Invest, 2004, 84 (7): 845-856.

7 Combaret V, Bergeron C, Bréjon S, et al. Protein chip array profiling analysis of sera from neuroblastoma patients[J]. Cancer Lett, 2005, 228 (1-2): 91-96.

8 Chan DC, Chen CJ, Chu HC, et al. Evaluation of serum amyloid A as a biomarker for gastric cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2007, 14 (1): 84-93.

9 蔡利励，谭立明，沈威，等. 血清淀粉样蛋白A对胃癌的临床诊断价值[J]. 中国实验诊断学, 2011, 15 (7): 1073-1076.

10 刘东红，张云，唐小万，等. 血清淀粉样蛋白A对早期胃癌诊断的研究[J]. 医学研究杂志, 2014, 43 (6): 107-110.

11 Wang J, Ma R, Sharma A, et al. Inflammatory serum proteins are severely altered in metastatic gastric adenocarcinoma patients from the Chinese population[J]. LoS One, 2015, 10 (4): e0123985.

12 Wu JY, Cheng CC, Wang JY, et al. Discovery of tumor markers for gastric cancer by proteomics[J]. PLoS One, 2014, 9 (1): e84158.

13 杨磊，杨书云，季建美，等. 葡萄糖调节蛋白78在胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 中华肿瘤杂志, 2013, 35 (11): 837-842.

14 Kang JM, Park S, Kim SJ, et al. KIAA1324 Suppresses Gastric Cancer Progression by Inhibiting the Oncoprotein GRP78[J]. Cancer Res, 2015, 75 (15): 3087-3097.

15 Chen S, Duan G, Zhang R, et al.Helicobacterpyloricytotoxin-associated gene A protein upregulates α-enolase expression via Src/MEK/ERK pathway: implication for progression of gastric cancer[J]. Int J Oncol, 2014, 45 (2): 764-770.

16 倪田根，高晨，周欣，等. 胃癌组织中烯醇化酶-α和肿瘤型丙酮酸激酶蛋白的表达及其临床意义[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2011, 18 (5): 524-527.

17 Liu YQ, Huang ZG, Li GN, et al. Effects of α-enolase (ENO1) over-expression on malignant biological behaviors of AGS cells[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8 (1): 231-239.

18 Yang J, Xiong X, Wang X, et al. Identification of peptide regions of SERPINA1 and ENOSF1 and their protein expression as potential serum biomarkers for gastric cancer[J]. Tumour Biol, 2015, 36 (7): 5109-5118.

19 Kwon CH, Park HJ, Lee JR, et al. Serpin peptidase inhibitor clade A member 1 is a biomarker of poor prognosis in gastric cancer[J]. Br J Cancer, 2014, 111 (10): 1993-2002.

(2016-06-02收稿；2016-08-25修回)

Application of Proteomics in Research of Biomarkers for Gastric Cancer

LANQingzhi,MAJingjing,DONGWeiguo.

DepartmentofGastroenterology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan(430060)

DONG Weiguo, Email: dwg@whu.edu.cn

Gastric cancer is one of the most commonly seen malignant tumors in digestive tract. Early diagnosis and treatment is crucial for the improvement of patients’ survival. By analyzing the proteins aberrantly expressed in gastric cancer using proteomics technologies, a series of proteins that are strongly related to the occurrence and development of gastric cancer have been identified, which are promising to be applied for the early diagnosis and prediction of patients’ prognosis. This article reviewed the recent advances in research on proteomic biomarkers for gastric cancer.

Stomach Neoplasms; Proteomics; Biological Markers; Diagnosis; Prognosis

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.015

*Email: 2011302180143@whu.edu.cn

#本文通信作者，Email: dwg@whu.edu.cn