Arvanil的绿色合成及其抗肿瘤活性

管月清，章鹏飞

(1.台州职业技术学院 医学与制药工程学院，浙江 台州 318000；2.杭州师范大学 材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036)

Arvanil的绿色合成及其抗肿瘤活性

管月清1*，章鹏飞2

(1.台州职业技术学院 医学与制药工程学院，浙江 台州 318000；2.杭州师范大学 材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036)

采用微波辐射、硅胶负载和催化合成辣椒素类似物Aranvil，在高产率地得到Aranvil的同时，建立了一种微波辅助、硅胶负载和催化合成辣椒素及其类似物的绿色合成新方法.该方法具有无需使用腐蚀性或毒性大的羧酸活化试剂、无溶剂、操作简单、反应时间短、收率高、环境友好等优点.并采用MTT法考察了Aranvil对脑胶质瘤C6细胞和人肝癌Huh7细胞的体外增殖抑制作用，结果显示Aranvil具有较好的抗肿瘤活性.

Arvanil；微波辐射；绿色合成；抗肿瘤活性

天然辣椒素是一种酰胺类化合物，主要存在于辣椒中.最早由 Thres(1876)从辣椒果实中分离出来，其化学名称为N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺，分子式为 C18H27NO3，此后又有一些辣椒素的同系物从辣椒果实中被发现，迄今为止已发现辣椒素同系物有14 种以上，它们都具有共同的母核(图1)，不同之处在于分子中的R基.

图1 辣椒素的母核结构Fig.1 Mother nucleus of capsaicinoids

辣椒素是辣椒中主要的辛辣成分，也是离子通道蛋白TRPV1(即辣椒素受体)的高选择性激动剂.辣椒素可通过激活TRPV1，引起细胞外钙离子内流，从而促进神经递质的释放、合成与贮藏，发挥抗炎、镇痛、止痒的作用[1-3].因此辣椒素既不会产生非甾体抗炎药常出现的副作用，也不会引起阿片类镇痛药的成瘾性，已成为临床医生治疗糖尿病性神经痛等疼痛的首选用药.近年来研究表明，辣椒素还具有防治心血管疾病、促进脂肪代谢、介导肿瘤细胞凋亡等功能，降低得慢性疾病的风险[4-6].2012年，STOCK等[7]在《Nature Medicine》杂志上发表了他们的最新研究成果.神经前体细胞(NPC)可以释放辣椒素来激活肿瘤细胞的TRPV1离子通道，进而诱导肿瘤细胞进行压力诱导的细胞死亡.此外，NPC介导的肿瘤抑制效应可通过人工合成的辣椒素类似物Arvanil(图2)全身给药在成年鼠脑中被模拟出来.该研究在表明辣椒素受体TRPV1为肿瘤等慢性疾病新靶点的同时，也为辣椒素类化合物可用于防治慢性疾病提供了有力的科学依据.因此，辣椒素及其类似物的合成和抗肿瘤活性的研究备受化学工作者的青睐.

图2 Arvanil的结构式Fig.2 Structure of arvanil

辣椒素及其类似物是属于酰胺类化合物，关于酰胺类化合物物的合成，目前人们大多数是采用羧酸活性中间体与胺进行亲核取代反应的化学合成方法[8-11].但现有方法部分存在反应条件苛刻、活化试剂腐蚀性和毒性大、副产物多、原子经济性差、环境污染大等不足.因此，开发一种快速、高效、环境友好地合成辣椒素及其类似物的新方法成为当前研究的重点课题之一.我们在前人的研究基础上[12]，采用微波辅射、硅胶负载和催化花生四烯酸与香兰素胺直接进行酰胺化反应，实现了辣椒素Arvanil的绿色合成(图3)，该方法具有无需使用腐蚀性或毒性大的羧酸活化试剂、无溶剂、操作简单、反应时间短、收率较高、环境友好等优点.本文还将合成所得目标产物进行了C6脑胶质瘤细胞和Huh7肿瘤细胞的抑制活性研究.

图3 辣椒素Arvanil的合成路线Fig.3 Synthesis of arvanil

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Bruker-500型核磁共振仪，Thermo Scientific LCQ质谱仪.所用试剂均为市售AR或CP.细胞培养箱和多功能酶标仪为美国Thermo公司产品；超净工作台购自上海智诚分析仪器制造有限公司；低速常温大容量离心机购自德国Sigma公司.MTT及其他试剂均购自上海生物工程有限公司.

1.2 Arvanil的合成

香兰素胺0.231 g(1.5 mmol)和花生四烯酸0.456 g(1.5 mmol)先溶解在乙酸乙酯(15 mL)中，随后与1.0 g硅胶60(230～400目)混合均匀，混合好后减压旋蒸去除溶剂，剩余物转移到微波试管中，并放入CEM型微波反应器中，功率设定200 W，温度设定130 ℃，恒温反应时间20 min.反应结束后，降到室温，并加入30 mL乙酸乙酯，超声20 min，随后过滤，滤饼硅胶用 30 mL乙酸乙酯淋洗.所得有机相经饱和的碳酸氢钠溶液和10%稀盐酸洗涤，硫酸镁干燥，过滤，浓缩和纯化得到无色液体0.57 g，收率88%.1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ：6.86 (d,1H),6.81 (s,1H),6.77 (d,1H),5.86 (m,2H),5.37(m,5H),4.35 (d,2H),3.88(s,3H),2.82 (m,3H),2.22 (d,3H),2.06 (m,3H),1.93 (m,2H),1.84～1.70 (m,2H),1.65 (m,2H),1.27 (m,6H),0.90 (t,3H);13C NMR (126MHz,CDCl3)δ：172.65,148.76,145.19,130.35,128.80,127,52,120.80,114.45,110.77,55.92,49.69,43.57,36.85,31.92,29.62,27.22,26.69,25.57,22.69,14,12; MS (ESI),m/z：440.31 [M+H]+.

1.3 Arvanil的抗肿瘤活性实验

采用四氮唑盐酶还原法(Microculture Tetrozolium,MTT)测定Arvanil对C6脑胶质瘤细胞和Huh7肿瘤细胞的抑制作用.具体操作：收集对数期细胞，用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔3 000～10 000个细胞；于37 ℃、5% CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6～24 h；加入6个梯度浓度的待筛样品20 μL，继续培养44 h；小心吸去上清液，加入80 μL新鲜RPMI-1 640培养液，再加入20 μL MTT溶液(5 g/L，即0.5% MTT)，继续培养4 h；然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)和对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔.

采用Logit法计算半数抑制浓度IC50.实验结果表明Aranvil对C6脑胶质瘤细胞和Huh7肿瘤细胞这两种肿瘤细胞均具有较好的活性抑制作用，IC50分别为3.69×10-5mol/L和2.98×10-5mol/L.

实验过程中，具体观察了Aranvil浓度在1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L给药量条件下对人肝癌Huh7细胞活性抑制效果，如图4所示，Aranvil浓度高于1×10-6mol/L时，Huh7细胞活性被有效抑制.

正常 1×10-6 mol/L 1×10-8 mol/L图4 Arvanil对人肝癌Huh7细胞的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of arvanil on hepatocellular carcinoma (HCC) Huh7 cells

2 结果与讨论

在合成辣椒素Aranvil的实验中，主要考察了酸与胺的用量、硅胶的用量；微波反应温度；微波反应时间对酸与胺的酰胺化反应的影响.实验结果表明反应在香草胺和花生十四烯酸投料物质的量比为1∶1、硅胶的用量为酸与胺的总投料量1～1.5倍，微波反应温度为130 ℃，反应时间为20 min时，酰胺化反应的转化率最好，Arvanil的收率最高(88%).反应过程中，无需使用任何溶剂及羧酸活化剂、反应时间短、反应副产物为水；反应结束后，只需经过超声萃取等简单的后处理操作便可得到目标产物，且硅胶可有效地回收再利用.整个试验过程高效便捷、环境友好.

其次，我们分别研究了Arvanil对脑胶质瘤C6细胞及人肝癌Huh7细胞的增殖抑制作用，发现Arvanil对上述两种肿瘤细胞均具有较好的活性抑制作用.

3 结论

通过对在微波辅射、硅胶负载和催化的条件下合成Arvanil的研究，建立了一种微波辅助、硅胶负载和催化合成辣椒素及其类似物的绿色合成新方法.该方法具有无需使用腐蚀性或毒性大的羧酸活化试剂、无溶剂、操作简单、反应时间短、收率较高、环境友好等优点.合成的目标产物具有较好的抗肿瘤活性，为后期作用机制研究和辣椒素抗肿瘤方面应用开发奠定了良好基础.

[1] CATERINA M J,LEFFLER A,MALMBERG A B.Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor [J].Science,2000,288:306-313.

[2] DAVIS J B,GRAY J,GUNTHORPE M J.Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia [J].Nature,2000,405:183-187.

[3] GUNTHORPE M J,CHIZH B A.Clinical development of TRPV1 antagonists:targeting a pivotal point in the pain pathway [J].Drug Discovery Today,2009,14:56-67.

[4] LI H B,MAO R R,ZHANG J C,et al.Antistress effect of TRPV1 channel on synaptic plasticity and spatial memory [J].Biological Psychiatry,2008,64(4):286-292.

[5] YANG D,LUO Z,MA S.Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension [J].Cell Metabolism,2010,12(2):130-141.

[6] LUO Z,MA L,ZHAO Z.TRPV1 activation improves exercise endurance and energy metabolism through PGC-1αupregulation in mice [J].Cell Research,2012,22(3):551-564.

[7] STOCK K,KUMAR J,SYNOWITZ M,et al.Neural precursor cells induce cell death of high-grade astrocytomas through stimulation of TRPV1 [J].Nature Medicine,2012,18:1232-1238.

[8] VALEUR E,BRADLEY M.Amide bond formation:beyond the myth of coupling reagents [J].Chemical Society Reviews,2009,38:606-631.

[9] LANIGAN R M,SHEPPARD T D.Recent developments in amide synthesis:direct amidation of carboxylic acids and transamidation reactions [J].European Journal of Organic Chemistry,2013,33:7453-7465.

[10] LANIGAN R M,STARKOV P,SHEPPARD T D.Direct synthesis of amides from carboxylic acids and amines using B(OCH2CF3)3[J].The Journal of Organic Chemistry,2013,78:4512-4523.

[11] BECERRA-FIGUEROA L,OJEDA-PORRAS A,GAMBA-SANCHEZ D.Transamidation of carboxamides catalyzed by Fe(III) and water [J].The Journal of Organic Chemistry,2014,79:4544-4552.

[12] OJEDA-PORRAS A,HERNANDEZ-SANTANA A,GAMBA-SANCHEZ D.Direct amidation of carboxylic acids with amines under microwave irradiation using silica gel as a solid support [J].Green Chemistry,2015,17(5):3157-3163.

[责任编辑：张普玉]

Green synthesis and antitumor activity of arvanil

GUAN Yueqing1*,ZHANG Pengfei2

(1.DepartmentofMedicalandPharmaceuticalEngineering,TaizhouVocational&TechnicalCollege,Taizhou318000,Zhejiang,China; 2.CollegeofMaterial,ChemistryandChemicalEngineering,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310036,Zhejiang,China)

An improved and green methodology,which has the advantages of free solvent,reducing the reaction time,mild reaction condition,simple operation,high yield and environmental friendship,has been developed for the catalytic synthesis of capsaicin and its analogues under microwave irradiation using silica gel as a solid support.To estimate the inhibitory effects of the arvanil,MTT assay in the cell lines,including C6 and Huh7,was adopted.The result showed that the target exhibited good inhibitory activity against the estimated cell lines.

Aranvil; microwave irradiation; green synthesis; antitumor activity

2016-11-29.

国家自然科学基金(21376058)，台州市科技计划项目(131KY07)，台州市博士后科研基金项目(2013BSH01).

管月清(1976-)，女，高级工程师，主要从事药物合成及分析.*

，E-mail：gbzhou_zju@126.com.

TQ031.2

A

1008-1011(2017)01-0027-04