环境条件对珠美海棠微枝试管内生根与成活的影响

杨广艳，王坤英，柴慈江，刘海静，关明月

珠美海棠（Malus zumi）为蔷薇科苹果属植物，具有较强的抗逆能力，抗白粉病和黑星病，较耐涝，并具有很强的耐盐能力，在含盐量0.4%左右的土壤中能够正常生长与开花结果[1]，是优良的耐盐苹果砧木和盐碱地绿化树种。因珠美海棠种子繁殖出苗率低、后代性状不稳定，且扦插繁殖成活率低[2]。因此，组织培养快繁技术是目前培育珠美海棠苗木的主要途径。

生根是植物组织培养快速繁殖技术的关键环节之一。试管苗的试管内生根培养一般是在恒温室进行，需消耗大量电力，加大了试管苗培养成本[3]。为降低试管苗培养成本，柴慈江等[4]、韩会会等[5]将栒子和无花果试管苗的试管内生根培养放在温室中进行并取得了理想的结果。本文探讨了露地、温室、恒温室3种环境条件对珠美海棠试管苗试管内生根培养的影响，以期降低珠美海棠试管苗培养成本，进一步完善珠美海棠组织培养快速繁殖技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为在附加0.5 mg/L 6-BA的MS培养基中继代培养的珠美海棠（Malus zumi）试管苗，试验取材时试管苗已在培养基中生长约90 d并长至2 cm以上。培养基用土取自天津农学院东校区校内，风干后过1 mm筛备用。并从市场上购买细粒蛭石，同样过1 mm筛备用。

以200 mL大口瓶为培养瓶，按V土壤∶V蛭石＝1∶2的比例混合均匀后加入培养瓶中，再加入不含琼脂的培养液，加入培养液的量以完全浸湿土壤混合物但表面不积液为度。培养液的成分为含有0.5 mg/L IBA和15 g/L蔗糖的蒸馏水，pH调至6.0。加入土壤混合物和培养液的培养瓶用双层聚丙烯膜封口后，在121℃下灭菌20 min，然后在超净工作台上每瓶接入5根长约1.5 cm的珠美海棠试管苗茎段。

1.2 试验方法

1.2.1 3种环境中珠美海棠微枝试管内生根培养试验

3月底，将上述接种了珠美海棠试管苗茎段的培养瓶放置在不同环境中进行生根培养。试验设温室、露地和恒温培养室3种环境处理。

（1）温室环境：将培养瓶放在塑料大棚日光温室中，上面用双层遮阳网覆盖，以便遮阴降温。

（2）露地环境：将培养瓶放在露地环境中的地面上，并用3层遮阳网遮阴。

（3）恒温室环境：将培养瓶放在恒温培养室的培养架上，由日光灯提供人工光源，并由空调机维持培养室内温度在25℃左右。

每个处理放置9瓶共45个茎段。培养期间，温室和露地环境中用温度计每隔约7 d观测一次培养瓶内的最高温度和最低温度，并用照度计测定不同环境中的光照强度。选择晴天和阴天的上午和中午测定温室和露地环境的光照强度，测定时将照度计感光部位放置在遮阳网下培养瓶上方，读取照度计上的数值，恒温室光照强度的测定则是在日光灯照明的时间里将照度计感光部位放在培养瓶上方测定。每次测定读取4次数值，取其平均数。

培养70 d后，调查试管苗生根率、根长、茎长、叶数等指标。各处理生根率的统计以3瓶15个茎段为1次重复，重复3次。其他指标则调查接种的全部茎段的数值。所有数据均按照单向分组资料的统计分析方法做方差分析。

1.2.2 3种环境中珠美海棠试管苗气孔开闭状况的观察

在生根培养的同时，每种环境中另放置3瓶接种了珠美海棠试管苗茎段的培养瓶，生根培养结束后，用于气孔观察。将3种环境下培养的珠美海棠试管苗，不经开瓶炼苗，置于密闭的黑暗环境中进行黑暗处理，第二天早晨，从试管苗上取正常展开叶片，用粘取下表皮法观察气孔开闭状况[6]。每种环境的试管苗取5片叶片，用胶粘带粘取下表皮放于载玻片上，在显微镜下观察气孔的开闭状况。每叶片随机观察50个气孔，统计其气孔关闭率，同时每叶片随机取10个气孔，用测微尺测量气孔的横径与纵径，用横径与纵径的比值表示气孔的相对开张度。最后对所有观测结果进行统计分析。

1.2.3 3种环境中珠美海棠试管苗的移栽试验

在上述生根培养的同时，每种环境中另外放置15瓶接种了珠美海棠试管苗茎段的培养瓶，培养瓶内置有提苗片用于移栽。生根培养结束后，将3种环境中培养的珠美海棠试管苗不经过炼苗直接进行移栽。移栽方法均采用带坨移栽法，其具体做法为：用提苗片将珠美海棠试管苗带土提出培养瓶，然后从提苗片上取下带土坨的试管苗，将试管苗带坨移入装有2/3湿润基质的营养钵内，再用基质将营养钵填满，最后浇透水。移栽基质为按V土壤∶V蛭石＝1∶2比例混合的混合物。移栽后不采取喷雾或覆盖塑料膜等保湿措施，只在营养钵表土见干时浇水。用温湿度自记仪记录环境温湿度变化。移栽47 d后调查试管苗的成活率。

2 结果与分析

2.1 3种环境中珠美海棠试管苗生根培养效果

露地、温室、恒温室环境下珠美海棠试管苗生根培养，培养效果如表1。

表1 3种环境对珠美海棠试管苗生根培养的影响

由表1可以看出，不同环境中生根培养的珠美海棠试管苗生根率、根数和茎长无显著性差异，根长和叶数存在显著性差异。温室中珠美海棠试管苗根长极显著高于露地和恒温室的根长，露地试管苗根长又极显著高于恒温室，表明露地和温室环境能够促进珠美海棠试管苗根部的生长。从试管苗的叶数看，恒温室培养的试管苗叶数极显著高于露地和温室，温室又极显著高于露地环境。3种培养环境中的珠美海棠试管苗生长状况见图1。

图1 3种环境中培养的珠美海棠试管苗生根状况

从生根培养期间3种环境的温度条件来看，环境不同，温度条件差异较大。恒温室环境中的温度比较恒定，基本维持在20～28℃之间，温室和露地环境中的温度均表现出昼高夜低的节律变化，这种昼高夜低的节律变温有利于试管苗光合产物的积累，因此促进了根系的生长，这可能是温室和露地环境中的试管苗根长明显高于恒温培养室的原因之一。同时，露地环境中的温度明显低于温室环境，瓶内最低温长期低于10℃，特别是在培养初期（3月底—4月初）遇到突然降温，最低温度低至5℃以下，甚至接近0℃，此时其叶片多已变成红色，并很快落叶，表明已经发生了冷害，这可能是导致其叶片数量显著低于温室和恒温室，并且根长显著低于温室的主要原因。温室环境中最高温度大多处于35℃左右，较高的温度也对叶片造成一定的伤害，试验中观察到有叶片边缘焦枯的现象发生，温度过高可能是其叶片数量显著低于恒温室环境的主要原因。露地、温室和恒温室培养期间温度测定结果变化如图2所示。

图2 生根培养期间3种环境中培养瓶内最高温度和最低温度的变化状况

从生根培养期间光照的调查情况看，3月下旬—5月上旬，露地光照强度为1 700～4 000 lx，温室光照强度为870～4 700 lx，恒温培养室光照强度870～2 000 lx。总体上看，露地环境与温室环境的光照强度接近并均明显高于恒温室环境的光照强度。光照强度增加可以促进光合产物的合成，为根系提供更多的有机营养，这可能是温室和露地环境促进珠美海棠试管苗根系生长的又一个原因。

2.2 3种环境中珠美海棠试管苗的气孔开闭观察

对露地、温室、恒温室生根培养的珠美海棠试管苗气孔开闭情况如表2所示。

表2 3种环境中珠美海棠试管苗在黑暗中的气孔开闭状况

由表2可见，在未经开瓶炼苗的条件下，3种环境下培养的珠美海棠试管苗在黑暗中的气孔相对开张度以恒温室环境的最大，但3者之间差异不显著。露地和温室中培养的试管苗的气孔关闭率分别为64.3%和52.0%，两者差异不显著，但均极显著高于恒温室中培养的试管苗的气孔关闭率。这表明露地和温室中培养的珠美海棠试管苗具有较强的关闭功能，其原因可能是露地和温室环境对珠美海棠试管苗产生了一定的驯化作用，这与在栒子和无花果的试验中取得的结果基本一致[4-5]。

2.3 3种环境中珠美海棠试管苗的移栽效果

对露地、温室和恒温室生根培养的珠美海棠试管苗移栽效果调查如表3所示。

表3 3种环境中珠美海棠试管苗的移栽效果

如表3所示，对露地、温室和恒温室生根培养的珠美海棠试管苗移栽效果进行调查，结果发现，不经过开瓶炼苗直接移栽，并且移栽后不采取保湿措施的条件下，露地和温室中培养的试管苗移栽成活率均达到96.7%，而恒温室中培养的珠美海棠试管苗的移栽成活率仅为36.7%。分析其原因，可能是露地和温室中培养的珠美海棠试管苗在生根培养期间获得了一定的驯化锻炼，地上部保水能力得到增强，因此提高了成活率。这也与栒子和无花果的试验结果基本一致[4-5]。

3 小结与讨论

在天津近郊3月底至5月中，在温室和露地环境中试管内生根培养的珠美海棠试管苗的生根率、根数和茎长与恒温室环境的试管苗无显著差异，但试管苗根长均极显著高于恒温室环境中的试管苗。温室和露地环境中培养的珠美海棠试管苗叶片气孔具有一定的关闭功能，不经炼苗进行移栽，试管苗成活率可达到96.7%，显著高于恒温室环境中培养的试管苗。

将试管苗的试管内生根培养由恒温培养室转为日光温室中进行，可以利用自然光照，省去了人工光照所需的电力消耗，因此能大幅度降低试管苗成本。以往对栒子和无花果试管苗生根培养的试验结果表明，将栒子和无花果试管苗的试管内生根培养放在日光温室中进行，均可以提高试管苗的生根质量，并且增强试管苗的环境适应能力，提高了试管苗的移栽成活率[4-5]。在本试验中，珠美海棠试管苗在温室中的试管内生根培养与移栽也取得了类似的结果。而且，本试验将珠美海棠试管苗的试管内生根放在露地中进行，也取得了与温室中同样的培养效果，这为进一步降低试管苗成本提供了一种新的可能。

以往的研究结果表明，珠美海棠试管苗在土壤支撑的培养基中的生根率可以高达100%[7]。本研究中珠美海棠试管苗的生根率普遍偏低，可能是所用的试管苗试材继代培养时间过长所致。王玉珍等[8]研究认为，继代培养苗龄为30～40 d时生根率最高，60～80 d时生根率明显降低。本试验中所用试材的苗龄为90 d，苗龄过长可能导致了生根率显著下降。此外，露地环境中培养初期温度过低可能也是导致露地环境中培养的试管苗生根率偏低的原因之一。对上述问题有待于进一步研究。

[1]王玉祥，刘静，乔来秋，等.41个引种树种的耐盐性评定与选择[J].西北林学院学报，2004，19（4）：55-58.

[2]孟晓烨，彭立新.珠美海棠研究进展[J].天津农学院学报，2009，16（4）：42-46.

[3]沈海龙.植物组织培养[M].北京：中国林业出版社，2005.

[4]柴慈江，曹海鹏，王琼，等.不同温室培养条件对栒子微枝试管内生根和成活的影响[J].天津农学院学报，2015，22（2）：11-15.

[5]韩会会，符玲巧，柴慈江，等.温室培养条件对无花果微枝试管内生根与成活的影响[J].天津农学院学报，2016，23（1）：23-27.

[6]陈佰鸿，李新生，曹孜义，等.一种用透明胶带粘取叶片表皮观察气孔的方法[J].植物生理学通讯，2004，40（2）：215-218.

[7]柴慈江，卢兴霞，苏卫国，等.珠美海棠试管苗的土壤支撑生根培养和带坨移栽[J].植物生理学通讯，2010，46（1）：33-36.

[8]王玉珍，冯学赞，罗景兰，等.珠美海棠组培苗繁殖技术的研究[J].生态农业研究，1999，7（2）：50-52.