混合脐血间充质干细胞诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的作用机制

王晓宁，焦红亮，杜 伟，李建斌，杨 波

(1.郑州大学附属郑州中心医院放疗科，河南 郑州 450007；2.郑州大学第一附属医院神经外科，河南 郑州 450052；3.河南省红十字血液中心，河南 郑州 450003)

脐血间充质干细胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)对胶质瘤细胞具有毒性和抑制增殖的作用。该实验经过将不同人源的UCB-MSCs混合，比较单份(1例孕妇来源的UCB-MSCs)与混合的UCB-MSCs(2例孕妇来源的UCB-MSCs)对C6胶质瘤细胞的抑制增殖和诱导凋亡的作用。采用免疫组化法检测C6胶质瘤细胞的Caspase-8、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。

1 材料与方法

1.1 间接共培养(Transwell小室)检测UCB-MSCs对EGFP-C6胶质瘤细胞的作用 为了检测C6胶质瘤细胞与UCB-MSCs之间的间接接触相互作用，通过C6胶质瘤细胞的荧光强弱来观察干细胞对胶质瘤细胞毒性作用，T(target，靶细胞即C6胶质瘤细胞)，E(effector，效应细胞即UCB-MSCs)。在Transwell板内，2×104个C6胶质瘤细胞接种于下室，UCB-MSCs接种于上室，中间由孔径为0.4 μm薄膜将上下室分开，从而检测UCB-MSCs分泌抑制性蛋白对C6胶质瘤的作用。单份UCB-MSCs和C6胶质瘤细胞数量比例(E/T)分别为01、11、51、101；混合UCB-MSCs和C6胶质瘤细胞数量比例(E/T)分别为(0.5 +0.5)1、(2.5+2.5)1、(5+5)1。Transwell板置于体积分数5% CO2、37 ℃培养箱孵育3 d后通过共聚焦显微镜和计算机图像分析系统检测C6胶质瘤细胞表达绿色荧光蛋白强度，所有实验均重复3次。

1.2 间接共培养细胞免疫组化检测Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达 固定细胞：吸弃培养基，3次PBS冲洗，每次4 min，质量分数4%多聚甲醛固定25 min。内源性过氧化物酶消除：3次PBS冲洗，每次4 min，体积分数3% H2O2去离子水孵育10 min。封闭血清：滴加山羊血清工作液，室温孵育15 min，倾去，不洗。孵育一抗：滴加一抗(适当比例稀释)，4 ℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min。孵育二抗：滴加生物素化二抗工作液，室温孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。显色：DAB显色剂。冲洗：自来水充分冲洗。复染：苏木素约5 min使细胞核显色。光镜下观察：中性树胶封片观察。

2 结果

2.1 UCB-MSCs与C6胶质瘤细胞间接共培养的荧光强度 在Transwell培养板内，按照不同比例UCB-MSCs处理C6胶质瘤细胞后，在荧光显微镜下检测荧光强度，结果显示，E/T=51组的C6胶质瘤细胞荧光强度与E/T=01组比较差异无统计学意义(P>0.05)，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1作用于的C6胶质瘤细胞后，强度均明显减弱(P<0.05)。C6胶质瘤细胞的荧光强度随着E/T比例增高而减低，呈现反比例依赖关系；同比例时，混合组比单份组的细胞强度低，其中E/T=(5+5)1时其强度最低。见图1。

2.2 免疫细胞化学法检测 Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白 Caspase-8、Bax和Caspase-3蛋白在E/T=01即有表达，染色强度浅，E/T=51时，蛋白表达水平较E/T=01有升高趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着E/T比例增加，表达水平逐渐升高，染色强度逐渐增强，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1时，Caspase-8蛋白表达阳性率与E/T=01比较显著升高(P<0.05)，其中E/T=(5+5)1时，其表达阳性率最高。Bcl-2在E/T=01染色强度高，E/T=51时，蛋白表达水平较E/T=01有减低趋势，但比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着E/T比例增加，表达水平逐渐减低，染色强度逐渐减弱，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1时，Bcl-2蛋白表达阳性率与E/T=01比较显著降低(P<0.05)。

图1 UCB-MSCs与C6胶质瘤细胞间接共培养的荧光强度

1)与E/T=51和E/T=(2.5+2.5)1，比较，P<0.05；2)与E/T=101，P<0.05

3 讨论

MSC具有向胶质瘤趋化的特性[1-4]及抑制肿瘤的生长已经有相关报道，而且脐血在获取材料、存储、移植等方便优于骨髓[5]。UCB-MSCs克服了神经干细胞存在的伦理等问题，具有向胶质瘤细胞趋化的特性[6]。Bcl-2是细胞凋亡研究中重要的癌基因之一，Bcl-2家族目前己经发现有20多个成员，例如凋亡蛋白Bax、Bik等，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bfl-1、Bcl-W等。Bcl-2基因主要分布在内质网、核膜上及线粒体外膜的浆膜面，其功能是阻止线粒体释放细胞色素C、Caspase及活化因子AIF，稳定线粒体膜。Bcl-2/Bax比值决定细胞是否凋亡[7]，Bax和Bcl-2具有拮抗作用，可以异源二聚体形式存在，也可形成同源二聚体[8]，Bax和Bcl-2可能是抗肿瘤治疗潜在靶点，Bax由6个外显子组成，产生4种mRNA，分别编码相对分子质量45 000、21 000和24 000的蛋白质。细胞中的Bax蛋白与Bcl-2蛋白形成异源二聚体复合物，使Bcl-2失活，也可自身形成同源二聚体。Bax表达增多时，Bax/Bax二聚体增加，使凋亡作用增强。Caspase激活可分为[9-10]：切开小亚基和大亚基；切开大亚基和前导区；大亚基和小亚基构成活性Caspase。另一种为效应的Caspase，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，有的不含死亡效应结构域，其与起始型Caspase结合后进一步被激活，凋亡的终结者是效应Caspase。

为了研究其具体机制，本研究应用免疫组化法检测C6胶质瘤细胞Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白，Caspase-8、Bax和Caspase-3在E/T=51时，蛋白表达较E/T=01有升高趋势，但差异无统计学意义。随着E/T比例增加，蛋白表达水平逐渐升高，Caspase-8、Bax和Caspase-3蛋白阳性表达与E/T比例正相关，同比例时，混合组比单份组的阳性表达数量多，其中E/T=(5+5)1时，数量最多，但是Bcl-2蛋白阳性表达数量与上述相反。

综上所述，混合的UCB-MSCs分泌各种细胞因子，如IL-2 和INF-γ等，作用于C6胶质瘤细胞，抑制细胞的增殖，通过上调Bax表达和下调Bcl-2表达，开放PTP孔，使细胞外膜破坏，线粒体膜电位消失，线粒体膜外的小分子进入到膜内，使得线粒体内外膜之间的细胞色素C等促凋亡因子的释放，凋亡蛋白活化因子与细胞色素C互相结合后，激活Caspase-8，使Caspase-3活化，进而促进胶质瘤细胞发生凋亡。

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