循环肿瘤DNA检测在恶性肿瘤诊治中的应用进展与问题思考

徐婷，徐国宾，b，贾淑芹，康晓征，张连海，季加孚

(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所a.检验科，b.分子诊断中心，c.胸部肿瘤外一科，d.胃肠中心，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142)

·专家论坛·

循环肿瘤DNA检测在恶性肿瘤诊治中的应用进展与问题思考

徐婷a，徐国宾a，b，贾淑芹a，康晓征c，张连海b，d，季加孚b，d

(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所a.检验科，b.分子诊断中心，c.胸部肿瘤外一科，d.胃肠中心，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142)

肿瘤组织是检测驱动基因突变的理想标本，获得组织标本的方式有内镜活检、淋巴结活检、手术切除等。对于失去手术机会的晚期肿瘤患者，临床很难获得或难以获得足量组织标本用于基因检测。循环肿瘤DNA(ctDNA)是肿瘤细胞坏死、凋亡释放入血的DNA，其基因组信息与肿瘤组织一致。晚期肿瘤患者ctDNA是良好的组织替代品，可作为靶向药物基因靶点检测的补充。常见ctDNA检测技术有突变扩增阻滞系统(ARMS)、数字PCR(dPCR)、新一代测序(NGS)等。不同方法原理不同，灵敏度不同，一次可检测的基因个数和位点也不同。该文对ctDNA检测及其在肿瘤早期诊断、用药指导、疗效评估、复发监测、预后等方面的研究作一简要概述，并阐述存在的问题和一些思考。

循环肿瘤DNA；核酸扩增技术；早期诊断；指导用药；疗效评价；复发监测；预后

驱动基因的检测是晚期肿瘤患者靶向药物选择的基础，肿瘤组织是靶基因检测的理想标本。获取组织标本的常见方式包括内镜活检、淋巴结活检、手术切除等。多数晚期患者往往难以接受有创检查，临床很难获得或难以获得足够量的肿瘤组织用于基因检测[1]。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)作为组织学基因检测的补充，在指导靶向用药方面具有潜在价值，并在肿瘤的早期诊断、预后判断、残留与复发监测和治疗反应监测等方面也具有潜在的应用价值。

1 ctDNA检测方法和原理

生理或病理状态下，细胞坏死或凋亡时细胞核内或线粒体内DNA会释放到血液、胸腔积液、脑脊液、尿液、痰液或粪便中。细胞外游离 DNA(cell-free DNA，cfDNA)是细胞 DNA 降解产物，片段大小约150～200 bp[2]。ctDNA作为 cfDNA 的一类，来源于肿瘤细胞，可反映肿瘤的异质性。血液中ctDNA半衰期为15 min至数小时[3]。人cfDNA 浓度多低于100 μg/L，平均约30 μg/L[4]；中晚期肿瘤患者cfDNA 浓度可高达 1 000 μg/L，平均约180 μg/L[5]。cfDNA中ctDNA占比较低。研究发现，中晚期肿瘤患者ctDNA占cfDNA的比例约为8%～10%，在肿瘤早期或治疗缓解后可低至0.01%～1.7%[3, 6-7]。ctDNA检测的主流方法有突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)、数字PCR(digital PCR，dPCR)、新一代测序(next-generation sequencing，NGS)等，各方法检测原理和灵敏度不同。低丰度ctDNA对检测技术的灵敏度要求很高。上述基于PCR技术的ctDNA检测方法要求加入的cfDNA起始量为30～80 ng，各方法的灵敏度、特异性和通量各不相同。对于ARMS和dPCR，不同试剂盒间的检测差异与ctDNA提取率、引物位置、探针修饰有关。对于基于PCR反应的NGS，其检测灵敏度除与样本处理有关外，还与每一步反应效率和测序深度有关。

1.1 ARMS ARMS技术利用探针或染料在实时荧光PCR平台上实现对特异引物扩增突变序列的检测。探针法较染料法特异性好、应用广[8-9]。ARMS检测特异性取决于引物特异性，1个反应中加入多个特异引物，可实现多重扩增，检测同一基因的多个突变。检测血浆ctDNA的商品化ARMS试剂盒有人表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测试剂盒(厦门艾德公司)、cobas®EGFRMutation Test v2(美国Roche公司)、therascreenEGFRPlasma RGQ PCR(德国凯杰公司)。人EGFR基因突变检测试剂盒可检测29种EGFR热点突变，灵敏度为1.0%[10]，已获国家药监局(CFDA)临床应用批准和欧盟ISO13485认证。该公司开发的新一代super ARMS试剂盒正在审批过程中，其灵敏度约为0.2%。cobas®EGFRMutation Test v2和therascreenEGFRPlasma RGQ PCR可检测的EGFR位点分别为42和23种，灵敏度分别为0.5%和1%，这两种试剂盒中EGFR19外显子缺失突变(exon 19 deletion)和 21外显子突变(L858R)的检测已获美国食品及药物管理局(FDA)批准和欧洲共同体体外诊断产品(CE-IVD)认证。

Liu等[11]用人EGFR基因突变检测试剂盒检测86例ⅢB-Ⅳ期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者组织和血浆EGFR突变，阳性率分别为46.5%(40/86)和31.4%(27/86)；40例组织EGFR突变型患者中，27例患者血浆中检测到EGFR突变，敏感性为67.5%；27例组织EGFR野生型患者血浆均未检测到EGFR突变，特异性为100%；该试剂盒检测血浆EGFR基因突变的敏感性较低，但特异性和阳性预测值高。有研究[12]显示治疗前组织EGFR突变丰度低于1%的患者较高于1%的患者使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)后的中位无进展生存时间(progression-free survival，PFS)和总生存时间(overall survival，OS)更短。而治疗前血浆中EGFR突变丰度低于0.04%的患者较高于0.04%的患者使用EGFR-TKI后的中位PFS更短[13]。

商品化ARMS试剂盒定性检测EGFR的灵敏度为0.5%～1%，可用于组织EGFR检测，但用于血浆EGFR检测时需慎重。血浆EGFR突变丰度与患者预后的关系还有待进一步研究，而选择高灵敏度ctDNA检测技术是开展这项研究的关键因素之一。

1.2 dPCR dPCR是一种核酸分子绝对定量技术，分为DNA单分子化、PCR扩增和荧光信号分析3部分。与ARMS检测存在大量cfDNA背景干扰不同，在dPCR扩增前样品被平均分配到几至几百万个单元中。由于每个单元中靶基因以单分子状态呈现，背景干扰少，解决了突变与野生DNA分子基础拷贝数不同而导致二者PCR扩增效率差异大的缺陷。dPCR以反应达到终点时每个反应单元是否具有荧光信号判定反应的阴阳性，根据泊松分布计算原始样本突变基因的拷贝数，实现核酸的绝对定量。探针特异的dPCR检出基因突变的灵敏度可高达0.005%～0.01%[14-18]，高于特异引物扩增的ARMS分析法。dPCR灵敏度除与检测器的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外，还取决于样本总量和可用于反应的单元总数。样本量足够时，可用于反应的单元总数越多，检测的灵敏度越高，准确度也越高。dPCR适用于拷贝数变异及突变的检测、二代测序结果及等位基因频率的验证等。

根据反应单元形成的方式不同，dPCR主要有微滴和微流控芯片2类。微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)源于乳液PCR技术[19-20]。ddPCR是在传统PCR扩增前将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的油包水微滴，对每个微滴同时进行PCR扩增，扩增结束后，依次采集每个微滴中的荧光信号。一个微滴发生卡可一次检测8个样本。目前应用较多的微滴技术平台有Rain DropTM数字PCR系统(美国Rain Dance公司)和QX200系统(美国Bio-Rad公司)。微流控芯片技术是一种基于超高密度亲疏水微孔芯片的dPCR 平台。该平台采用包含20 000 个微孔的超高密度芯片作为反应载体。每张芯片只能检测一个样品。目前采用微流控芯片技术的平台有Bio-MarkTM基因分析系统(美国Fluidigm公司)和QuantStudioTM3D数字PCR系统(美国Life Technologies公司)。

一项前瞻性研究[21]采用ddPCR分析了29例早期乳腺癌患者肿瘤组织和ctDNA中PIK3CA突变，在15例肿瘤组织中检测到PIK3CA突变的患者中，有14例患者外周血中检测到PIK3CA突变，14例肿瘤组织阴性患者均未在ctDNA中检测到PIK3CA突变(敏感性为93.3%，特异性为100%)。但dPCR一次只可检测一个已知突变。若需要检测靶基因的多个敏感突变位点，则需行多次dPCR。例如，需要检测肺癌患者血浆EGFR基因L858R、E746_A750del、G719X和T790M 4个位点时，则需进行4次dPCR反应，操作繁琐耗时。

1.3 SBE结合MALDI-TOF-MS 该技术首先通过多重PCR同时扩增多个待测基因突变和野生目的片段，然后加入虾碱酶水解PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和针对待测基因的引物。其后，在反应系统内加入单碱基延伸引物，该引物的3′末端碱基与待检突变位点的前一个碱基互补。采用4种双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)替代dNTP参加反应。由于ddNTP在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基，故不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键。探针在突变位点处仅延伸一个碱基，且连接上的ddNTP与突变位点的碱基互补。经树脂纯化后的延伸产物和非延伸引物与芯片基质共结晶，用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜。基质从激光中吸收能量传递给核酸分子，核酸分子解吸附并转变为离子。产物离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而测定离子的质荷比(m/z)，从而确定该位点的碱基。

Margulies等[22]收集122例Ⅲ～Ⅳ期黑色素瘤患者石蜡包埋组织和配对血浆，采用ARMS法检测肿瘤组织中BRAFV600E突变；与组织检测结果相比，质谱法和ARMS法检测ctDNA的阳性一致率分别为76.4%(55/72)和54.2%(39/72), 阴性一致率分别为98%(49/50)和96%(48/50)。单碱基延伸技术(single base extension,SBE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)可同时检测同一基因或多个不同基因已知的热点突变，检测通量较大，操作时间短，成本低，也可定量检测突变丰度。突变基因质谱法检测的灵敏度约为1%，并且由于多重PCR的循环数较多(约40个循环)，突变DNA分子和野生DNA分子可能存在非等倍扩增现象，导致质谱法检测到的突变丰度与实际丰度存在一定偏差。

1.4 NGS NGS可实现对多基因核酸片段进行高通量平行深度测序，定量检测突变丰度，发现未知突变。cfDNA加入量足够时，NGS的灵敏度(0.02%～5%)取决于测序深度[23-25]。美国Illumina公司和Life公司是目前使用较广泛的测序平台。Illumina公司测序分为文库构建、桥式PCR扩增和可逆性末端边合成边测序3部分。采用超声或酶切法将待测基因组DNA样本打断为100～200 bp小片段，这些小片段两端连接不同粘性末端接头，构建单链DNA文库。血浆cfDNA不需经过处理，可用于文库构建。将生物素标记的捕获探针与单链DNA文库混合，目标区域基因片段被杂交到探针上，采用亲和素包被的磁珠捕获杂交到探针上目标区域基因片段，去除未被吸附的基因片段。将经过富集的目标区域基因片段洗脱下来即可获得目标区域基因片段DNA文库。文库中具有粘性末端接头分子可与flowcell表面附有的互补探针结合。当含DNA文库的反应液流过flowcell表面时，每条连接有粘性末端接头的单链DNA片段与flowcell表面的接头牢牢结合在一起。每条固定在flowcell表面的DNA片段都经过桥式PCR扩增形成各自的簇，即每个簇都由单个DNA模板的很多个拷贝组成。桥式扩增结束后向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和4种带有荧光标记的dNTP。这些dNTP的3′-OH被叠氮基保护，不能与下一个dNTP形成磷酸二酯键，因而每次只能添加一个dNTP。dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶被水洗脱掉。再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号，计算机分析系统根据4种不同颜色的荧光信号确认碱基种类。荧光信号记录完成后，加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3′-OH叠氮基团，暴露dNTP 3′-OH。再加入新的dNTP、 DNA聚合酶和接头引物，进行下一轮测序反应，如此循环，直到记录下每条模板的碱基序列。

Life公司测序分为文库构建、乳液PCR扩增和可逆性末端边合成边测序3部分。小片段DNA的两端连接上平端接头，构建单链DNA文库。其目标区域基因片段的捕获方法与Illumina平台相同。将包含单链DNA文库、5′端标记生物素的接头引物、DNA聚合酶和测序微珠(表面连接有与平端接头互补的引物序列)的水溶液混合均匀后，加入油，油和水混合后形成的每个小微滴中都包含0到若干个文库分子和测序微珠，每个微滴同时进行独立的PCR反应，反应结束后，测序微珠上就连接了同一微滴中扩增出的生物素标记的DNA分子。破坏微滴结构，加入链霉亲和素标记的磁珠，磁珠会和发生PCR反应的带有生物素的测序微珠结合，富集这些测序微珠，然后通过洗脱液把磁珠富集的测序微珠洗脱下来。Life测序芯片含有数以百万、千万计的小孔。每个小孔既是测序微珠的容器，又是一个微型的pH计。测序时将测序微珠的混悬液从芯片的进口注入，当混悬液流过芯片时，每个测序微珠沉积在1个小孔中。测序时碱基ACGT依次连续流过芯片。如果核苷酸与小孔中DNA 分子互补，则该核苷酸与DNA 分子结合，释放1分子焦磷酸，1个焦磷酸分子被酶进一步分解为2个磷酸分子(即两个酸性分子)。一个测序微珠上有几百、几千条DNA链，因此，每次发生聚合反应，每个测序微珠就会释放出几百、几千个酸性分子，小孔的pH值下降。芯片中每个小孔中的离子传感器检测到pH 变化后，即刻将化学信息转变为数字电子信息。如果DNA 链含有连续两个相同的碱基，则有双倍的酸性分子释放，记录的电压信号也是双倍的。如果碱基不匹配，则无酸性分子释放，也就没有电压信号的变化。不同研究中，与组织相比，不同ctDNA检测方法的阳性一致率(敏感性)、阴性一致率(特异性)和总一致率存在差异，这种差异可能与组织异质性和肿瘤分期(以往的研究，多选择晚期肿瘤的患者)相关。不同ctDNA检测方法针对不同分期的真阳性和真阴性的头对头比较研究(head to head comparative trial)目前未见报道。

2 ctDNA检测在恶性肿瘤中的应用

2.1 早期诊断 早期肿瘤患者cfDNA含量低，ctDNA丰度低，对检测灵敏度要求高。虽然ctDNA在肿瘤早期筛查中的价值并未被看好，但其仍然受到关注。2014年，Newman等[23]从肿瘤基因图谱库407位NSCLC患者全基因组测序结果和肿瘤基因突变数据库筛选139个基因设计成NGS检测组合，该组合基因突变在肺腺癌或鳞癌患者中发生率为96%。研究者将这种方法命名为癌症个体化深度测序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing， CAPP-Seq)。与组织结果相比，CAPP-Seq在Ⅰ期(4例)和Ⅱ～Ⅳ期(9例)NSCLC中检出基因突变的敏感性分别为50%和100%，在各期NSCLC中特异性为96%。ctDNA用于肿瘤早期诊断，除需高灵敏度的技术，还需设定合适的基因组合。由于不同种类的肿瘤突变谱不同，设定的基因组合最好能覆盖不同肿瘤80%～90%突变。

2.2 微小残留病灶和复发监测 液体活检，包括ctDNA和循环肿瘤细胞(CTC)，在微小残留病灶和复发监测中的应用研究成为近2年来的热点，在微小残留病灶检测和复发预警中具有潜在应用价值。ctDNA对于微小残留病灶评估和复发监测研究多集中于直结肠癌和胰腺癌。Tie等[26]对178例术后未接受辅助化疗的Ⅱ期结肠癌患者进行为期4年的追踪试验。研究者采用NGS(Illumina公司)监测血浆体细胞突变。患者于术后每6个月接受一次全身CT扫描，4～10周内、10周后每3个月分别采集新鲜外周血。采用NGS对连续收集的外周血浆行6个基因外显子突变检测，术后ctDNA阳性和阴性患者例数分别为14和164，复发率分别为78.6%(11/14)和9.8%(16/164)，无复发生存时间分别为7.9和27个月；提示ctDNA检测或可作为病灶是否完全清除的指标，对部分早期结肠癌患者肿瘤复发风险具有预测作用。Reinert等[27]还比较了影像学、癌胚抗原(CEA)、ctDNA监测结直肠癌术后早期复发的性能，发现ctDNA较CEA升高和影像学发现改变早10个月。微小残留病灶和复发的早期发现对于复发的早期干预和延长患者生存时间非常重要。早期肿瘤患者血清蛋白质类肿瘤标志物阳性率低，对于微小残留检测价值有限。肿瘤患者术后复发监测主要靠影像学和蛋白质类肿瘤标志物，但前者不能及时反映患者病情的进展，后者敏感性低。ctDNA在监测结直肠癌和胰腺癌患者术后微小残留病灶和复发方面具有一定价值，但在其他肿瘤中的应用价值以及向临床转化还有待进一步研究。

2.3 疗效评价 肿瘤疗效评价为基于影像学检查的实体瘤疗效评价标准[28]。血清蛋白质类肿瘤标志物的变化与影像学疗效评价的一致率不超过50%[29]。近2年来，已有ctDNA用于晚期肺癌、结直肠癌治疗的耐药预警[23,26-27]，较早的相关研究发表于新英格兰医学杂志[30]。该项研究采用靶向或全基因组测序检测了52例正接受全身性治疗的转移性乳腺癌患者肿瘤基因组改变，采用ddPCR或靶向测序检测组织基因突变阳性患者(以PIK3CA和TP53基因突变居多)血浆中对应基因突变拷贝数改变。研究还检测了相同时间点CA15-3水平和CTC数量。CTC检测采用CellSearch平台。研究验证NGS检测ctDNA突变丰度与ddPCR具有良好的一致性。该研究发现在30例组织中检测到基因突变患者的外周血中ctDNA检出的阳性率为97%，而CTC和CA15-3阳性率分别为87%和78%。与影像学结果相比，无论用NGS或ddPCR检测的ctDNA水平动态改变与肿瘤负荷改变一致性好，且两者的关联性优于CA15-3及CTC。ctDNA可以成批检测，避免影像学检查的长时间等候预约。ctDNA中多个突变基因检测可以反映肿瘤克隆的演变，但向临床转化还需要大规模多中心的前瞻性研究。

2.4 指导靶向药物使用 癌组织基因检测对于指导靶向治疗具有重要意义。2015年2月CFDA批准对吉非替尼说明书的更新，新说明书要求晚期NSCLC患者治疗前应检测组织EGFR突变，但如不可获得或不可获得足够的肿瘤组织时，则可检测血液标本中ctDNA并评估，以鉴别出最可能从吉非替尼治疗中受益的NSCLC患者。2015年，《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》也提出当肿瘤组织难以获取时，血液是EGFR基因突变检测合适的替代生物材料，也可作为对可疑组织检测结果的补充[31]。2014年，Weber等[32]分别采用Roche公司组织和血浆EGFRARMS-PCR试剂盒检测196例Ⅱ～Ⅳ期NSCLC患者肿瘤组织和对应血浆中EGFR基因突变，血浆EGFR突变患者使用TKI治疗的PFS显著长于EGFR未突变者(5.7个月 vs 2.8个月)。该研究中组织和血浆EGFR突变的检出例数分别为28例和24例，组织和血浆总一致率为179/196(91%)。血浆EGFR定性和定量检测对于指导NSCLC靶向用药十分重要。2016年，文献[33]报道采用ddPCR检测73例组织EGFR突变的晚期肺腺癌患者TKI治疗前和治疗后不同时间段血浆中EGFR突变频率，治疗前血浆EGFR突变频率0.04%～5.15%的患者，其PFS显著短于血浆EGFR突变频率>5.15%的患者(11.1个月 vs 15.4个月)，但显著长于血浆EGFR突变频率<0.04%的患者(11.1个月 vs 6.7个月)。该项研究还发现治疗后血浆EGFR丰度下降患者的PFS(12.7个月 vs 7.1个月)和OS(overall survival，总生存时间)(28.3个月 vs 14.9个月)均显著长于治疗后未下降者。目前已有部分厂家可检测血浆中的某些融合基因，如ALK、ROS1等，但这些技术之间的阳性一致率、阴性一致率以及检测结果能否指导用药，进一步改善患者转归还未见报道。

耐药是靶向治疗的必然结果，耐药突变基因检测有助于耐药的发现和治疗方案的调整。TKI治疗后耐药的晚期NSCLC患者中EGFRT790M突变率约为50%，T790M突变患者被推荐使用AZD9291。2014年，Oxnard等[34]采用dPCR连续监测9例晚期肺癌患者厄洛替尼治疗过程中血浆中EGFRT790M突变，结果6例患者进展，这6例患者的血浆中均检测到T790M 突变。该研究显示血浆T790M突变可在影像学发现疾病进展前8～24周被检测到，提示ctDNA动态监测可及时发现T790M耐药基因位点，有助于临床及时更换方案。

组织KRAS基因突变检测已被NCCN指南推荐为结直肠癌患者用抗EGFR治疗前的检测项目，KRAS基因突变患者不推荐用西妥昔单抗(抗EGFR)治疗。早在2010年，比利时De Roock等[35]采用质谱法检测750例接受西妥昔单抗治疗的转移性结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA基因的突变状态，并分析这些基因的突变状态与患者的治疗反应率、PFS和OS的关系，发现KRAS突变型患者的治疗反应率、中位PFS和中位OS均低于KRAS野生型患者(治疗反应率：6.7% vs 35.8%；中位PFS：12周 vs 24周；中位OS：32周 vs 50周)。目前血浆KRAS基因突变检测用于指导用药还未达成专家共识，但未来或可先通过血浆KRAS基因检测，免除对血浆KRAS基因突变阳性患者的活检。结直肠癌血浆KRAS检测的阳性预测值受到关注。2015年，Danese等[36]采用ARMS法检测了85例Ⅰ～Ⅳ期(以Ⅱ～Ⅲ期为主)结直肠癌患者血浆和新鲜冰冻组织中KRAS突变。组织KRAS基因突变阳性率为34%。与组织相比，血浆检测KRAS突变的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为85%、93%、84.6%和93%，血浆和组织KRAS检测的总一致率为89.4%。同年，Spindler等[37]采用ARMS法检测211例Ⅳ期转移性结直肠癌患者石蜡包埋组织和血浆中KRAS突变，组织中KRAS基因突变率为66.4%。与组织相比，血浆检测KRAS突变的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80%、95.8%、97.4%和70.8%，血浆与组织KRAS检测的总一致率为85.3%。以上研究结果表明血浆KRAS基因检测在中、晚期结直肠癌中具有理想的阳性预测值。术后或不可手术晚期胃肠间质瘤患者组织C-KIT和PDGFR及晚期黑色素瘤患者组织BRAFV600E和C-KIT基因突变应用于前者选择伊马替尼和后者选择威罗替尼。胃肠间质瘤、黑色素瘤血浆基因突变检测也应该具有意义。

2.5 生存评估 研究显示年龄、性别、病理类型、T分期、N分期、淋巴结采样数量与NSCLC患者术后生存有关[38]，而初始ctDNA定性和定量检测预测肿瘤患者生存的研究少见。Kinugasa等[39]采用ddPCR检测了75例Ⅱ～Ⅳ期(Ⅲ～Ⅳ期患者占97%)胰腺癌患者肿瘤组织和cfDNA中KRAS突变，结果在肿瘤组织和cfDNA中检测到KRAS突变比例分别为74.7%和62.7%。研究发现，组织KRAS基因检测阳性和阴性患者OS差异无统计学意义(351 d vs 301 d)，而ctDNA检测阳性患者OS较阴性患者短 (413 d vs 276 d)。Sanmamed等[14]采用ddPCR检测19例组织BRAFV600E突变的晚期黑色素瘤患者治疗前外周血中BRAFV600E的浓度(copies/mL)，结果在16例患者外周血中检测到BRAFV600E突变。研究发现OS超过2年的患者，其初治时血浆BRAFV600E浓度较OS短于2年的患者低(27 copies/mL vs 478 copies/mL)。以216 copies/mL为临界值，ctDNA低于临界值患者的PFS和OS较ctDNA高于临界值的患者长(PFS：9个月 vs 3个月；OS：27.7个月 vs 8.6个月)。肿瘤患者的生存与肿瘤病理类型、肿瘤分期和负荷、生理状况等诸多因素相关。目前已有研究综合患者的临床资料，包括年龄、性别、吸烟史、病理类型、分期、淋巴结采样数目等构建模型，评估患者预后，但未见结合临床资料和ctDNA浓度及丰度评估预后的模型。该模型的构建或能更好地评估肿瘤患者的预后。

3 存在的问题与思考

不同分析技术平台的涌现实现了ctDNA基因检测从单基因到多基因、定性到定量的发展。ctDNA在实体肿瘤中的应用研究层出不穷，目前只有血浆EGFR检测被推荐作为组织检测的补充，用于指导晚期NSCLC患者的靶向用药。ctDNA检测在早期诊断、微小残留检测和复发监测、治疗效果评价、生存评估中的应用价值仍在研究和验证中。ctDNA检测的临床应用价值已经受到关注，正逐步进入临床应用。不同ctDNA检测平台的分析性能和临床诊断性能的评价、ctDNA的规范检测应该受到关注。以下4个方面值得思考。

3.1 ctDNA反映肿瘤异质性的能力 肿瘤异质性是基因检测和肿瘤治疗面对的难题。肿瘤异质性主要表现为不同个体之间、不同癌细胞之间、原发灶和转移灶之间、不同转移灶之间的异质性。ctDNA能反映肿瘤异质性是其检测优势。组织中基因突变频率与癌组织占有的比例及突变与未突变的克隆比例有关。研究发现晚期肺癌患者血浆EGFR和晚期结直肠癌患者血浆KRAS检测的敏感性可达60%～80%，说明ctDNA可敏感地检测出大部分晚期肺癌和晚期直结肠癌患者携有该突变的克隆。哪些肿瘤患者血浆ctDNA可作为组织基因检测的替代材料需要深入研究。对于进展期患者，如果转移灶靶基因检测阴性，而血浆检测阳性，可能与取得的活检标本未包括有突变的克隆有关。要验证此假设，需对患者进行多部位活检或尸检，比较活检或尸检组织与ctDNA检测的一致性。类似研究仅有个案报道。

3.2 不同平台检测ctDNA基因突变的一致性与假阳性 不同平台检测ctDNA突变结果不一致令临床和患者困惑。检测结果不一致与方法不同、同一方法不同平台的敏感性及特异性、对检出信号阳性阈值的设置不同有关。如前所述，dPCR检测的灵敏度最高，可达0.1%。基于ARMS和NGS的检出灵敏度有的仅达1%，有的可接近0.2%～0.5%。如用于复发监测、靶基因丰度改变的监测、疗效评估、结局预测，则要求该技术的灵敏度达到0.1%，且可定量报告ctDNA丰度和拷贝数。我们的研究初步发现当晚期NSCLC患者血浆EGFR突变丰度>1%时，ARMS、ddPCR和NGS的阳性一致率、阴性一致率均高于90%，而当突变丰度<1%时，较低灵敏度的某ARMS产品与较高灵敏度的NGS和ddPCR平台的阳性一致率低于15%。似乎1%的检出敏感性是评价基于PCR检测ctDNA的不同平台检测能力的分水岭。文献和我们的研究均发现EGFRT790M(ACG>ATG)阳性结果的报告富有挑战性，该位点的C碱基可自发脱氨基生成U，且该点位于CpG岛内，C碱基的甲基化可增加其脱氨基的风险，三联密码子对应的氨基酸由苏氨酸(T)变成甲硫氨酸(M)，从而出现假阳性。有厂家通过提高该位点的判读阈值来降低假阳性率。

样本前处理也影响ctDNA检测结果。使用含不同种类细胞保护剂样本采集管和样本采集后放置的时间、cfDNA提取试剂种类都会影响ctDNA检测结果的阴阳性，未见到相关系统研究报告。

3.3 优化分子病理检测和液体活检的流程 不同平台检测ctDNA的通量不同，价格相差很大。合理和优化使用ctDNA检测以减轻患者负担受到重视。合理应用ctDNA检测的指导意见有待讨论与出版。为此，分子病理检测和液体活检流程的优化被纳入了“重大慢性非传染性疾病防控研究”2017年度重点专项的资助范围。

ARMS检测价格适宜，一次可检测单个基因的多个已知突变，操作简单。检测已知的、单个临床上可用药物抑制的靶点(如EGFR、KRAS、BRAF等基因突变)，ctDNA检测推荐ARMS法。dPCR是近年来发展起来的具有高灵敏度的新技术，其一个反应只能定量检测一个已知突变位点，对于多个突变位点的检测，需要更多的样本量，操作繁琐，价格较ARMS贵。目前有许多厂家试图开发dPCR试剂盒。dPCR现多用于临床研究。dPCR检测敏感突变的基线丰度以及治疗过程中ctDNA的丰度消涨对于疗效评价和生存评价具有价值，是一个具有应用潜力的技术。NGS可定量检测多个基因的多个位点。NGS检测ctDNA突变丰度可与dPCR相当。普通和超灵敏的NGS成本高，但最具应用潜力。以EGFR检测为例，由于多数研究发现术后复发患者的EGFR突变状态与患者数年前的组织EGFR检测结果具有良好的一致性，所以当原始组织标本可获得时，采用ARMS检测组织EGFR突变状态用于指导用药可行。需动态监测者可采用dPCR监测血浆EGFR突变以用于疗效评价和预后评估，该模式具有较好的分子检测经济学。普通NGS尚不能完全取代EGFR等突变基因的ARMS检测、ALK和ROS1等融合基因的免疫组化或逆转录PCR检测，但其在肿瘤组织基因突变检测中的应用将越来越广泛。如经济条件允许，可首先直接采用普通NGS检测组织基因突变谱，其后采用dPCR或超灵敏NGS平行定量检测血浆驱动基因以及其他基因突变丰度消涨以预测肿瘤克隆演变。目前血浆中ALK、ROS1等融合基因的NGS检测方法正在开发中。临床医生应该向患者说明不同检测技术的检测性能(包括灵敏度、特异性、假阳性、通量等)及花费，让患者做出适合自身检测的选择。

3.4 ctDNA标准品的研制 ctDNA检测质控品的研发和室间质量评价计划刚起步。含突变位点的细胞系基因组DNA或重组质粒均可作为ARMS和dPCR检测的质控物。由于ctDNA片段小，制备与ctDNA长度相当、基质与血浆类似的参考物用于NGS的质量控制应该受到关注，此类参考物也适用于ctDNA ARMS和dPCR的质量控制。英国Horizon Discovery 公司发布了商品化的ctDNA标准品，该标准品来源于细胞系基因组DNA。近2年来，美国病理学家协会也启动了ctDNA检测的室间质量评价。与人血浆ctDNA性质相似的标准品制备瓶颈包括DNA的片段化和ctDNA突变丰度的定值。片段化DNA包括超声法和酶切法，有学者认为酶切法产生的DNA片段用于建库的效率更高。ctDNA突变丰度的定值较困难。理论上采用具有100%突变频率的细胞系基因组DNA与野生型细胞系勾兑可完成配制。但细胞系的基因组突变与健康人的胚系基因突变不同，纯合型和杂合型突变的频率多不是100%和50%，难以克隆到某基因突变频率为100%的细胞系，即便寻找到或克隆到这类细胞系，传代对突变丰度的影响也不清楚。期待突变丰度赋值准确、基质与血浆类似、内含的DNA建库效率高、片段大小与ctDNA一致、适用于NGS质量控制的参考品问世。

[1]Xue C, Hu Z, Jiang W,etal. National survey of the medical treatment status for non-small cell lung cancer (NSCLC) in China[J]. Lung Cancer, 2012, 77 (2): 371-375.

[2]Fleischhacker M, Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer--a survey[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1775 (1): 181-232.

[3]Diehl F, Schmidt K, Choti MA,etal. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics[J]. Nat Med, 2008, 14 (9): 985-990.

[4]Langford MP, Redens TB, Harris NR,etal. Plasma levels of cell-free apoptotic DNA ladders and γ-glutamyltranspeptidase (GGT) in diabetic children[J]. Exp Biol Med, 2007, 232 (9): 1160-1169.

[5]Anker P, Stroun M. Circulating DNA in plasma or serum[J]. Medicina, 2000, 60 (5 Pt 2): 699-702.

[6]Diehl F, Li M, Dressman D,etal. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102 (45): 16368-16373.

[7]Holdhoff M, Schmidt K, Donehower R,etal. Analysis of circulating tumor DNA to confirm somaticKRASmutations[J]. J Natl Cancer Inst, 2009, 101 (18): 1284-1285.

[8]Baris I, Etlik O, Koksal V,etal. SYBR green dye-based probe-free SNP genotyping: introduction of T-Plex real-time PCR assay[J]. Anal Biochem, 2013, 441 (2): 225-231.

[9]姜文灿，岳素文，江洪，等. TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展[J]. 临床检验杂志, 2015, 33(1): 797-805.

[10]Liu W, Hu T, Chen Y,etal. Development and validation of a tetra-primer amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction combined with melting analysis-assay for clinicalJAK2 V617F mutation detection[J]. Mol Diagn Ther, 2014, 18 (5): 579-585.

[11]Liu X, Lu Y, Zhu G,etal. The diagnostic accuracy of pleural effusion and plasma samples versus tumour tissue for detection ofEGFRmutation in patients with advanced non-small cell lung cancer: comparison of methodologies[J]. J Clinl Pathol, 2013, 66 (12): 1065-1069.

[12]Zhou Q, Zhang XC, Chen ZH,etal. Relative abundance ofEGFRmutations predicts benefit from gefitinib treatment for advanced non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2011, 29 (24): 3316-3321.

[13]Yang X, Zhuo M, Ye X,etal. Quantification of mutant alleles in circulating tumor DNA can predict survival in lung cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(15): 20810-20824.

[14]Sanmamed MF, Fernandez-Landazuri S, Rodriguez C,etal. Quantitative cell-free circulatingBRAFV600E mutation analysis by use of droplet digital PCR in the follow-up of patients with melanoma being treated withBRAFinhibitors[J]. Clin Chem, 2015, 61 (1): 297-304.

[15]Watanabe M, Kawaguchi T, Isa S,etal. Ultra-sensitive detection of the pretreatmentEGFRT790M mutation in non-small cell lung cancer patients with anEGFR-activating mutation using droplet digital PCR[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21 (15): 3552-3560.

[16]Zhu G, Ye X, Dong Z,etal. Highly sensitive droplet digital PCR method for detection ofEGFR-activating mutations in plasma cell-free DNA from patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. J Mol Diagn, 2015, 17 (3): 265-272.

[17]Oshiro C, Kagara N, Naoi Y,etal.PIK3CAmutations in serum DNA are predictive of recurrence in primary breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res Treat, 2015, 150 (2): 299-307.

[18]Taly V, Pekin D, Benhaim L,etal. Multiplex picodroplet digital PCR to detectKRASmutations in circulating DNA from the plasma of colorectal cancer patients[J]. Clin Chem, 2013, 59 (12): 1722-1731.

[19]Tawfik DS, Griffiths AD. Man-made cell-like compartments for molecular evolution[J]. Nat Biotechnol, 1998, 16 (7): 652-656.

[20]Margulies M, Egholm M, Altman WE,etal. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J]. Nature, 2005, 437(7057): 376-380.

[21]Beaver JA, Jelovac D, Balukrishna S,etal. Detection of cancer DNA in plasma of patients with early-stage breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20 (10): 2643-2650.

[22]Mosko MJ, Nakorchevsky AA, Flores E,etal. Ultrasensitive detection of multiplexed somatic mutations using MALDI-TOF mass spectrometry[J]. J Mol Diagn, 2016, 18 (1): 23-31.

[23]Newman AM, Bratman SV, To J,etal. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage[J]. Nat Med, 2014, 20 (5): 548-554.

[24]Forshew T, Murtaza M, Parkinson C,etal. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA[J]. Sci Transl Med, 2012, 4 (136): 1-14.

[25]Rothe F, Laes JF, Lambrechts D,etal. Plasma circulating tumor DNA as an alternative to metastatic biopsies for mutational analysis in breast cancer[J]. Ann Oncol, 2014, 25 (10): 1959-1965.

[26]Tie J, Wang Y, Tomasetti C,etal. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and predicts recurrence in patients with stage II colon cancer[J]. Sci Transl Med, 2016, 8 (346): 1-11.

[27]Reinert T, Scholer LV, Thomsen R,etal. Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery[J]. Gut, 2016, 65 (4): 625-634.

[28]Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J,etal. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1)[J]. Eur J Cancer, 2009, 45 (2): 228-247.

[29]陈阳阳，张洁，徐国宾. 晚期肺癌患者一线化疗后6 种血清肿瘤标志物水平的变化及意义[J]. 临床检验杂志, 2015, 33 (2): 124-129.

[30]Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M,etal. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer[J]. N Engl J Med, 2013, 368 (13): 1199-1209.

[31]《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》制. 非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识[J]. 中华医学杂志, 2015, 95 (46): 3721-3726.

[32]Weber B, Meldgaard P, Hager H,etal. Detection ofEGFRmutations in plasma and biopsies from non-small cell lung cancer patients by allele-specific PCR assays[J]. BMC Cancer, 2014, 14 (294): 1-6.

[33]Yang X, Zhuo M, Ye X,etal. Quantification of mutant alleles in circulating tumor DNA can predict survival in lung cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7 (15): 20810-20824.

[34]Oxnard GR, Paweletz CP, Kuang Y,etal. Noninvasive detection of response and resistance inEGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20 (6): 1698-1705.

[35]De Roock W, Claes B, Bernasconi D,etal. Effects ofKRAS,BRAF,NRAS, andPIK3CAmutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis[J]. Lancet Oncol, 2010, 11 (8): 753-762.

[36]Danese E, Minicozzi AM, Benati M,etal. Comparison of genetic and epigenetic alterations of primary tumors and matched plasma samples in patients with colorectal cancer[J]. PLoS One, 2015, 10 (5): 1-11.

[37]Spindler KL, Pallisgaard N, Andersen RF,etal. Circulating free DNA as biomarker and source for mutation detection in metastatic colorectal cancer[J]. PLoS One, 2015, 10 (4): 1-14.

[38]Liang W, Zhang L, Jiang G,etal. Development and validation of a nomogram for predicting survival in patients with resected non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2015, 33 (8): 861-869.

[39]Kinugasa H, Nouso K, Miyahara K,etal. Detection of K-ras gene mutation by liquid biopsy in patients with pancreatic cancer[J]. Cancer, 2015, 121 (13): 2271-2280.

(本文编辑：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.02.01

徐婷，1989年生，女，博士研究生，研究方向为肿瘤液体活检技术的应用；徐国宾，1963年生，男，研究员，博士研究生导师，研究领域为肿瘤生物化学与分子生物学检验；徐婷与徐国宾对本文具有同等贡献，同为第一作者。

季加孚，教授，博士研究生导师，E-mail：jijiafu@hsc.pku.edu.cn。

R446；R730.3

A

2016-12-20)