多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测*

邵奕霖，徐小平，高菊逸(1.南昌大学研究生院医学部，南昌 330006；.香港大学深圳医院，广东深圳 518053)

·综述·

多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测*

邵奕霖1,2，徐小平2，高菊逸2
(1.南昌大学研究生院医学部，南昌 330006；2.香港大学深圳医院，广东深圳 518053)

致病菌常规检测方法以培养鉴定为主，该方法周期长，培养条件苛刻，难以做到快速检测。微流控芯片具有小型化、高通量、快速、集成、耗材少等优点，近年得到了快速发展并逐步应用于各个领域。利用微流控芯片技术可实现细菌的快速检测，将该技术与其他技术相结合也得到了广泛应用。该文就近些年联合其他细菌检测方法设计的微流控芯片进行了综述，并探讨各种协同方法的优缺点及临床应用前景或价值。

微流控芯片；细菌；快速检测

微流控芯片(microfluidic chip)技术是在微米级通道内操控微量流体的技术，通过微进样技术和对微通道内流体的控制，可将芯片分隔成多个功能模块，包括样品分选室、富集室、反应室、检测室等，也被称为微整合分析芯片(micrototal analytical systems)。微流控芯片在细菌检测上具有巨大潜力，已发展成多学科交叉的新型研究领域。目前利用传统检测方法设计制作的芯片包括化学芯片和基因芯片。现就几种芯片的优缺点综述如下。

1 电化学芯片

细菌悬液经负压吸引通过检测孔时，因细菌体积大小、表面性质的不同产生不同的脉冲信号，经放大、分选后累加记录，可将脉冲信号转化为细菌数量和种类等相关信息。近些年，电阻抗技术也被应用到微流控芯片上。Mejri等[1]制作的芯片有3个3 mm×3 mm独立检测室，每个检测室包绕有交错的微金电极，联合红外光谱检测大肠埃希菌，检出限(limit of detection，LOD)达到104CFU/mL。Syed等[2]设计的纳米微电极芯片基于双向电泳和嵌入式垂直碳纳米纤维，能在高流速(1.6 mm/s)菌液中捕获大肠埃希菌。Del等[3]建立的芯片实现了实时监控交叉电极室的细菌积累状况，整个系统自动化集中操作，通过远程计算机控制，仪器记录电阻抗的变化来检测大肠埃希菌。电化学芯片检测细菌具有灵敏、快速等优点。传统电阻抗法检测细菌时待测细菌浓度需达到106～107个/mL时才会有明显脉冲信号，而电阻抗芯片降低了细菌检出所需的浓度。由于可选电极多样，微流控芯片个性化的设计，二者的结合方式成为未来电阻抗芯片的研究方向。但电阻抗芯片对设备要求及设计成本高，在以后的研究中应努力降低材料成本。

2 等温扩增基因芯片

环介导等温体外扩增是利用2对具有链置换活性的BstDNA聚合酶，让引物在等温条件(60～65 ℃)下顺利结合，并在30～60 min内完成特异、快速的扩增。因该技术具有易操作、耗时少等特点，使其在体外扩增领域得到了广泛应用。秦奎伟等[4]建立了一种NOA81型环介导等温扩增芯片用来检测沙门菌属，该技术结合微流控芯片耗材少、小体积、集成化等优点和等温扩增技术操作简单、扩增时间短、灵敏度高等特点，能快速检测细菌。Xia等[5]设计的芯片上有散射状排布的20个直径为0.8 mm的微通道，91个微孔，能同时检测腊样芽胞杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、河流弧菌和副溶血弧菌，其中对河流弧菌的检出限为7.2 copies/μL，并且检测以上5种细菌的准确率达100%。Safavieh等[6]设计的微流控芯片，恒温扩增大肠埃希菌DNA，利用荧光染料(Hoechst 33258)直接对DNA染色，减少了富集大肠埃希菌的步骤，缩短检测时间，使其检出限为24 CFU/mL。2016年，Oh等[7]将等温扩增技术协同洛黑T比色检测法在大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌和副溶血弧菌的混合物中，检测大肠埃希菌O157:H7检出限为380 copies/μL。联合等温扩增技术的微流控芯片，具有恒温扩增、耗时短、易操作等优势，在临床即时诊断(point-of-care testing，POCT)的应用中具有很大的潜力，易于在医院推广。

3 化学荧光芯片

免疫荧光检测是将特异性抗原抗体反应、荧光标记、荧光显微镜结合起来的检测技术，能对细菌定性或定量分析。张望等[8]利用免疫荧光设计的芯片同时检测10个样本，耗时少、高通量，检测大肠埃希菌O157：H7的敏感性和特异性分别为62%和100%。纳米荧光检测则是利用高强度荧光、低背景荧光干扰且具有高选择性的纳米荧光探针对细菌快速检测。Nuchtavorn等[9]设计的毛细管电泳微流控芯片，利用尼罗蓝进行标记，通过激光诱导荧光(laser induced fluorescence，LIF)在30～40 s内能对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和假丝酵母菌快速分离标记。与传统荧光染料相比，纳米荧光不仅具有更高的荧光强度以及稳定性，同时具有更好的生物相容性，可在几十分钟内实现对细菌的实时跟踪检测[10-11]。Mitchell等[12]将氨基化纳米磁珠(magnetic bead，MB)和羧基化量子点(QD655)结合而设计了一种芯片，对大肠埃希菌O157:H7菌液DNA定量检测，通过芯片分选富集和荧光信号放大检测，其检出限达到了4.9×10-14mol/L。随着量子点和荧光纳米探针的不断研发，纳米荧光探针会慢慢代替现有的有机荧光材料，联合微流控技术设计的荧光芯片能实现对细菌灵敏快速的检测，具有很好的发展前景。

4 化学发光芯片

拉曼光谱是分子的振动光谱，分子结构的变化能在拉曼光谱上反映出来，并可以对物质定性和定量分析。对比普通光学检测法，增强拉曼光谱(surface-enhanced raman scattering，SERS)和微流控芯片的结合能实现细菌的快速检测[13]。Cheng等[14]设计的微流控芯片利用有拉曼光谱活性的粗糙电极对细菌进行富集，仅3 min将原浓度为5×103CFU/mL的菌液富集提高约1 000倍，并能在1 min检测出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，而且在细菌的富集和检测过程中未使用抗体和其他化学试剂。Deng等[15]设计的微流控芯片联用介电电泳技术和SERS富集检测金黄色葡萄球菌，在15 s内完成对金黄色葡萄球菌的分选富集，并在富集区利用SERS技术完成检测。SERS具有谱带宽、检测无损、处理简单、灵敏度高、抗光漂白等优点。微流控芯片联合光学检测技术制备的光谱芯片对于微小检测物具有很高的灵敏度，在细菌快速检测上的应用仍具有很好的发展前景。

5 基因芯片

微流控平台结合PCR技术则具有高通量、耗材少、耗时短、多分析模块等优势。朱强远等[16]将数字PCR协同微流控芯片，可同时检测4个样本，由于进样、分选和检测都在密闭的芯片内部，避免环境可能对结果造成的污染。Julich等[17]建立的基因芯片通过联用磁珠对捕获的DNA进行高效的洗涤和洗脱，检测水表面苏云金杆菌和土拉热杆菌，其检出限分别为102GE(genome equivalents)/mL和103GE/mL。PCR检测芯片不受通道尺寸的影响，具有很高的准确度和灵敏度。基因芯片的构建是未来实现快速准确诊断的发展方向。法国生物梅里埃公司通过基因芯片分离扩增基因片段，生物分析仪检测，建立了全自动微生物分型系统(DiversiLab System)，实现了基因芯片的产品化。

6 结论与展望

微流控技术的发展为POCT的实现提供了一个平台。化学芯片是将芯片作为微反应器通过控制液滴，实现高通量化学反应，提高了检测灵敏度；小样本检测也为即时诊断提供了方便快速的检验结果。基因芯片有两个特点，一是对细菌的检测不受微通道空间的影响，具有很高的灵敏度和准确度；另一个是不受标本来源的约束，不存在检测环境对标本检测的影响。

未来微流控芯片将结合3D打印技术建立仿生实验室，在芯片上构建感染的器官，模拟细菌在体内生活的微环境，同时通过构建的器官芯片模拟抗生素对细菌的作用效果，为临床治疗提供参考。微观上，基因芯片通过将大量的DNA探针集成在一块芯片上，使其与带有荧光标记的DNA样本进行杂交，通过检测杂交信号强度来采集样本的基因序列，从而实现细菌准确、快速、大量的检测。

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(本文编辑：周万青，刘群)

深圳市科技创新项目[(2013)171号,(2016)148号]；深圳市科技计划项目(201101004)。

邵奕霖，1992年生，男，技师，硕士研究生，研究方向为微流控芯片在临床检验诊断上的应用。

徐小平，主任技师，E-mail: jyoxu@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2016.04.16

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2016-11-10)