蛋白结合毒素与慢性肾脏病及其心血管并发症

赵景宏

·述评·

蛋白结合毒素与慢性肾脏病及其心血管并发症

赵景宏

近年来的流行病学调查结果显示，我国慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患病率高达10.8%，且有逐年增高的趋势[1]。CKD并发症主要包括心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、矿物质骨质代谢紊乱、贫血等，其中CVD是CKD患者最主要的并发症和首位死亡原因，但截止目前CKD及其心血管并发症的机制仍未完全阐明。近年来，蛋白结合毒素对CKD及CVD的影响日益受到关注，此类毒素与血浆白蛋白结合，因相对分子质量大，极难被普通透析清除，可以长时间存在于血液循环，对机体造成不良影响。因此，我们对蛋白结合毒素加重CKD及诱发CVD的机制和临床清除治疗方式进行简要阐述。

一、蛋白结合毒素及其生成

2003年，欧洲尿毒症毒素研究组将已知的毒素进行了一次全面的总结和归类，国内学者以此为基础进一步将毒素分为3类：①水溶性、不与蛋白结合的小分子溶质(相对分子质量大多<500)，如尿素和肌酐；②中分子物质(相对分子质量大多>500)，主要是肽类(如甲状旁腺素等)；③蛋白结合物质，该类毒素与蛋白结合，形成大分子复合物，不易通过传统透析清除，我们通称为蛋白结合毒素，比较有代表性的是硫酸吲哚酚(indosyl sulfate，IS)和硫酸对甲酚(p-cresyl sulfate，PCS)。蛋白结合毒素多由硫酸盐、糖苷、甘油或谷氨酰胺的前体组成，其组成原则与药物类似，就是保证其有足够好的水溶性和蛋白结合性。这些前体物质中绝大多数是肠道细菌发酵的产物(如对甲酚和吲哚)；对甲酚来自食物中的酪氨酸和苯丙氨酸，吲哚则来自食物中的色氨酸。大肠细菌在蛋白结合毒素生成过程中发挥重要作用。对甲酚是苯丙氨酸和酪氨酸经肠道厌氧菌作用的代谢产物，肠道菌群产生的对甲酚经门静脉入肝，再经硫酸化形成PCS和葡萄糖醛酸酐对甲酚。吲哚是色氨酸经肠道细菌作用的代谢产物，在肝脏内经羟化生成3-羟基吲哚，再经硫酸化作用进一步转化为硫酸吲哚酚[2]。这两种毒素正常情况下可经肾近曲小管分泌自尿液排出，当肾功能下降时，肾小管排泌功能也随之下降，导致其不断积累，引起一系列病理性损伤[3]。

二、蛋白结合毒素的危害及机制

Niwa[4]研究发现，蛋白结合毒素的血清水平与CKD患者死亡风险呈正相关，是CKD患者重要的非传统危险因子，这可能与其肾脏毒性作用有关。另一项临床研究发现，血清IS水平与CKD患者的高CVD发病率有关[5]。Lin等[6]和Krishnasamy等[7]的研究也显示维持性血液透析患者的血清IS及PCS水平与CVD病死率密切相关，而血清IS水平偏低的患者其左室功能紊乱的发病率较低。这就表明，蛋白结合毒素在CKD进展和CVD发病中发挥重要作用。

1.蛋白结合毒素的肾脏损害作用 研究证实，蛋白结合毒素的蓄积会加速CKD进展，其中IS的作用尤为突出[8]。另外，临床研究表明，血清IS和PCS水平可以预测各期CKD患者肾功能下降的风险，而AST-120，一种口服吸附剂，可以通过下调上述毒素水平延缓CKD进展[3]。近年来研究发现，IS及PCS可以通过促进氧化应激、激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统等多种途径加重肾脏损伤[3]。

(1)IS诱导氧化应激导致肾间质纤维化，系膜细胞增殖：肾功能下降时蓄积的IS可以诱导活性氧(reactive oxygen species，ROS)过量生成、抑制抗氧化物的活性、打破氧化-抗氧化平衡，促进氧化应激，导致肾小管上皮细胞损伤。受损的肾小管上皮细胞分泌大量细胞因子[如转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白1及细胞间黏附分子1]，并发生上皮-间充质转分化。上述细胞因子又促使巨噬细胞浸润并分泌大量的TGF-β1、组织金属蛋白酶抑制剂1及I型胶原，最终导致肾间质纤维化[3]。IS和PCS均可以通过促进氧化应激诱导炎症因子生成引发炎症反应，导致肾纤维化[9]。与此同时，IS还可以通过诱导肾小球系膜细胞的ROS生成促进氧化应激、激活MAPKs信号，导致系膜细胞增殖，引起肾小球硬化[10]。

(2)IS加速肾脏衰老：IS可以加速肾脏衰老。我们及多个研究小组均发现，IS可以下调抗衰老蛋白Klotho在肾脏的表达，而Klotho蛋白是肾脏纤维化的主要抑制因子[11-12]。此外，IS还可以促进受损内皮细胞衰老标志蛋白SA-β-gal表达[13]，这些结果均提示IS可以加速肾脏衰老，但是到目前为止，IS加速肾脏衰老的具体机制尚未深入阐明，有待进一步研究。

(3)IS导致肾脏氧代谢异常：研究显示，IS可以通过促进氧化应激增加肾小管上皮细胞的氧耗量[3]。IS可以抑制进展期CKD患者缺氧诱导基因表达，这可能是CKD患者缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)功能性抑制的原因之一。此外，IS还可以使促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)生成细胞即肾皮质近曲小管管周细胞的氧传感器敏感性下降，导致EPO生成减少，加重CKD患者贫血[3，14]。

(4)IS和PCS激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统：IS和PCS均可以通过增加肾素、血管紧张素及血管紧张素Ⅰ受体表达，减少血管紧张素Ⅱ受体表达激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统。最近有研究在人近端小管上皮细胞中也进一步证实了IS促进血管紧张素表达的作用，其机制可能与上调核因子κB和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase，Nox4)有关[15]。

2.蛋白结合毒素的心血管损害作用 血清IS和PCS水平均与CKD患者的CVD发病有关，但有关IS的研究更为多见，IS的心血管损害作用可以分为直接损害和间接损害两个方面。一方面，IS可以通过促进氧化应激激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统、Akt信号通路等方式诱导心肌重塑，最终引发心力衰竭、心律失常等不良后果；IS也可以通过促进氧化应激、抑制一氧化氮生成，诱导炎症反应等多种机制促进血管平滑肌细胞增殖、大动脉异常钙化、内皮功能紊乱及细胞衰老，加速血管损伤。另一方面，IS还可以促使细胞内氧化-抗氧化平衡失调、下调细胞保护性蛋白Klotho及EPO等方式发挥间接性心血管损害作用。

(1)IS对心脏的直接损害作用及其机制：①IS通过促进氧化应激激活下游信号诱导心肌重塑。早在2009年就有研究发现，血清IS浓度与氧化应激标志物水平呈正相关[16]。随后研究证实，IS可以通过促进氧化应激导致多种心脏损害，包括心肌纤维化、心肌肥大、心肌细胞凋亡等[17]。我们的前期研究也发现，IS不仅可以促进Nox来源的ROS生成，还可以通过抑制AMPK/UCP2信号通路增加线粒体来源的ROS生成。此外，我们进一步研究发现IS可以通过激活Nox/ROS/MAPK信号通路诱导心肌肥大，而抗衰老蛋白Klotho可以逆转IS的上述作用[18-19]。②IS通过激活AngⅡ/TGF-β信号促进心肌纤维化。血管紧张素Ⅱ可以通过上调TGF-β表达导致心肌纤维化[20]。有研究发现，IS可以激活肾素血管紧张素系统调节microRNA表达、诱导心肌纤维化[21]。有报道则发现IS可以通过促进ROS生成诱导表皮生长因子受体表达进而激活血管紧张素Ⅱ信号通路[22]。这就提示IS可能通过血管紧张素Ⅱ信号上调TGF-β表达诱导心肌纤维化。③IS通过激活Akt/GSK3β信号通路诱导心脏重塑。在过去的20年中，研究发现Akt/GSK3β信号通路在心肌重塑中发挥关键作用。PI3K与G蛋白偶联受体结合后激活Akt及其下游的GSK3β信号，进而促进心肌肥大[23]。近年来，有研究发现IS可以通过促进Akt磷酸化诱导心肌细胞纤维化标志物的表达[24]。因此，PI3K/Akt/GSK3β信号也可能参与IS诱导的心肌重塑[24]。

(2)IS对血管的直接损害作用：①IS诱导血管平滑肌细胞增殖。动脉粥样硬化是CKD患者的主要血管病变，血管平滑肌细胞增殖是其发生、发展的关键环节。Yamamoto等[25]研究发现IS不仅可以诱导内皮功能紊乱，还可以通过激活MAPKs信号促使血管平滑肌细胞增殖。还有研究表明，IS可以通过诱导氧化应激促进人动脉平滑肌细胞增殖。其可能机制是IS通过活化Akt/TSC/mTOR/S6K信号途径诱导血管平滑肌细胞增殖[26]。②IS诱导血管炎症。炎症也是动脉粥样硬化发病的重要环节。血清IS水平与维持性血液透析患者的高炎症状态密切相关。既往IS促进炎症的研究仅局限于近端肾小管上皮细胞。最近，越来越多的研究提示IS也可以促进血管炎症，而其清除剂AST-120可以改善血管炎症及动脉粥样硬化病变程度[27-31]。关于IS促进血管炎症的具体机制目前报道较多，提示这可能是多靶点作用的结果。一项在人脐静脉内皮细胞中的研究显示，IS诱导血管炎症与芳香烃受体激活有关[27]。Ito等[28]研究发现IS可以通过上调Nox并激活p38 MAPK依赖的信号通路导致单核细胞趋化，进而诱导血管炎症。也有研究指出，IS可以通过活化OAT3/AhR/核因子κB信号通路导致白细胞介素6表达上调，诱导血管炎症[29]。此外，IS还可以促进内皮细胞白细胞黏附及E-选择素表达，增强血管壁炎症反应[30-31]。③IS诱导动脉钙化[32]。动脉钙化与CKD患者CVD的发生率及病死率密切相关。临床及动物研究均提示，IS可以诱导动脉钙化，而AST-120则可以改善CKD动脉钙化[32]。但是，IS诱导动脉钙化的相关机制研究报道较少。最近，有一项研究发现IS可以促进人血管平滑肌细胞钙化，其机制可能与血管平滑肌细胞Klotho蛋白分泌受抑，细胞磷的摄入增加有关[33]。因此，IS诱导动脉钙化的机制仍需进一步研究。④IS诱导血管衰老。血管衰老可以导致心肾综合征进展。有学者在高血压模型鼠的研究中发现IS可以促进血管衰老，但其机制不明[34]。Adelibieke等[35]研究发现IS通过促进ROS过量生成、激活p53诱导内皮细胞衰老。Muteliefu等[36]研究也提示IS促进血管平滑肌细胞衰老与增强的氧化应激有关。另外，IS还可能通过激活AhR导致iNampt-NAD(+)-Sirt1系统受损，诱导内皮衰老[37]。

3.IS对心血管的间接损害作用

(1)IS导致氧化-抗氧化失衡：多项研究表明，IS诱导氧化应激与其打破氧化-抗氧化平衡有关。一方面，IS可以通过上调Nox诱导ROS过量生成[18]。另一方面，IS又可以抑制抗氧化酶一氧化氮合酶活性，下调UCP2、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、Nrf2等抗氧化蛋白表达[19，38]。IS的这一作用导致机体氧化应激增强，进而诱导心、肾纤维化及血管炎症等病变。

(2)IS下调Klotho表达：Klotho是一种主要在肾脏表达和分泌的抗衰老蛋白。近年来的研究显示，Klotho还具有抗氧化应激、抗炎、抗凋亡等多种细胞保护作用[39]。我们的既往研究发现Klotho可以抑制炎症因子单核细胞趋化蛋白1表达，改善心肌重塑，而IS可以抑制Klotho表达[11，18-19，39]。国外研究者也发现IS可以通过诱导DNA启动子甲基化导致Klotho表达下调，而IS清除剂AST-120可以逆转IS诱导的Klotho下调和细胞衰老[12]。Shimizu等[40]的研究显示，IS下调Klotho表达还与其增加ROS生成和激活核因子κB有关。

(3)IS减少EPO生成：EPO由肾脏皮质近曲小管管周细胞分泌产生，是红细胞生成过程中必不可少的内生激素，CKD患者随着病情进展，EPO生成也逐渐减少。研究显示，EPO的生理作用不仅限于促进红细胞生成，还可以作用于内皮细胞、神经细胞，起到内皮及神经保护作用[41]。Chiang 等[14]发现，IS以一种HIF依赖的方式下调EPO mRNA表达。随后，Adelibieke等[42]发现IS通过抑制Akt磷酸化下调EPO表达。另外，IS下调EPO表达还可能与其促进内质网应激激活转录因子4有关[43]。EPO生成减少一方面会加重肾性贫血，导致心肌细胞缺血缺氧，引起心脏损害；另一方面，其内皮保护作用也会被削弱。

三、蛋白结合毒素的清除

1.血液净化治疗 蛋白结合毒素由于其蛋白结合特性，很难通过普通透析方式清除。目前，高通量透析被报道在清除该类毒素中起一定作用，尤其对IS的清除效果较好，但疗效并不确切。在多种透析方式中，对流被认为可以更有效的清除蛋白结合毒素。当然，该类毒素的清除也有赖于弥散模式。相比单纯的血液滤过，血液透析滤过对蛋白结合毒素的清除效果更佳。另外，有研究显示增加透析膜面积和透析液流速也可以促进蛋白结合毒素清除，当使用两个透析器并保证每个透析器的透析液流速≥800 ml/min时，其毒素清除效果甚至优于对流模式，每周行3次夜间透析或增加每次的透析时长也有助于IS及PCS的清除[44]。此外，血浆分离联合吸附、白蛋白透析也有助于蛋白结合类尿毒素的清除，但治疗费用比较昂贵，推广应用较少[45]。

2.口服吸附剂治疗 1991年，日本学者在全世界首次介绍了AST-120。AST-120是一种珠状、多孔、高纯度、可口服的活性碳，可强力吸附饮食来源的糖基终产物和尿毒素，并促进这些毒素从消化道排出体外，同时也可以通过吸附肠道中的吲哚减少血清IS水平。该药物在日本及韩国已经开始用于CKD患者的临床治疗。临床研究显示，CKD患者用药24周后，血清IS水平呈剂量依赖性下降，氧化应激标志物减少，血管舒张功能明显改善，肾功能下降速度减慢，同时服用该药物可以延迟CKD患者开始透析的时间，增加透析患者及非透析患者的生存率，减少CKD患者的住院天数及住院率，但针对该药物尚无长期疗效的观察结果，其长期疗效仍待明确[45]。

3.其他 包括口服益生菌、低蛋白饮食、保护残肾功能等。研究显示，口服益生菌可以通过保护肠道菌群减少IS生成[46]。另一项研究指出，饮食结构对IS的生成也有影响，他们发现素食者与正常人群相比有更低的IS水平[47]。此外，也有研究者发现腹膜透析患者血清蛋白结合毒素水平较维持性血液透析患者低，导致这种差异的原因可能与饮食习惯、残余肾功能及肠道功能有关[48]。

四、展望

综上所述，随着CKD进展，蛋白结合尿毒素在血液中不断蓄积，对肾脏本身及心血管等其他器官均会产生不利影响，并与CKD患者的死亡风险及心血管事件发生独立相关。然而，迄今为止蛋白结合毒素的病理损伤机制仍未完全阐明，亦没有一种明确的方式可以高效的清除此类毒素。目前，血浆分离联合吸附、白蛋白透析有助于该类毒素清除，但费用较为昂贵，保护残肾功能、低蛋白质饮食也是可以考虑的方式，但一般为辅助治疗，AST-120虽已投入临床应用，但长期疗效未知。因此，不论是蛋白结合毒素的病理损伤机制还是其清除策略，未来还需要更为广泛深入的研究和探索，并在此基础上使CKD及其心血管并发症获得更好的防治效果。

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10.3969/j.issn.1671-2390.2017.05.001

400037 重庆，第三军医大学新桥医院肾内科

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