重症监护病房分离金黄色葡萄球菌的分子流行特征

杨玉琪，徐修礼，马越云，史皆然，周 珊，周 磊，郝晓柯

(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032)

·论著·

重症监护病房分离金黄色葡萄球菌的分子流行特征

杨玉琪，徐修礼，马越云，史皆然，周 珊，周 磊，郝晓柯

(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032)

目的 了解某三甲医院重症监护病房(ICU)患者分离金黄色葡萄球菌的分子流行特点及其同源性，为有效控制医院感染的发生提供实验室依据。方法 收集该院2013年3—8月ICU患者各类感染标本分离的62株金黄色葡萄球菌，采用PCR方法扩增7个管家基因并进行测序分析，采用多位点序列分型(MLST)技术获得菌株ST分型，对ST分型进行亲缘关系分析。结果 62株金黄色葡萄球菌均可以扩增出7个管家基因的特异性产物；共分为10个ST基因型，其中2个基因型为新发现的ST型(STn1和STn2)，1个为国内新发现的ST型(ST675)。ST239是ICU患者分离的金黄色葡萄球菌主要ST型别，占74.20%，分布于6个ICU，分布范围最广；其次为ST5，分布于3个ICU。62株菌株在系统进化树上形成7个主要分支，检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)55株，占88.71%。结论 医院ICU分离的金黄色葡萄球菌具有一定的同源性，并且少数型别表现出集中分布趋势。

重症监护病房； 金黄色葡萄球菌； 多位点序列分型； 基因； 同源性

[Chin J Infect Control，2017，16(2)：99-103]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为革兰染色阳性球菌，是一种重要的病原菌，也是近年来引起医院感染的主要病原菌之一[1]。金黄色葡萄球菌由于传播途径广、致病性强、抵抗力较强，在医院内的传播较为广泛，已经成为医院感染预防和控制的棘手问题[2]。金黄色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococusaureus，MRSA)，已经引起临床医务人员越来越多的重视，而且金黄色葡萄球菌医院内传播也成为医院感染控制的重点问题。因此，分析临床分离的金黄色葡萄球菌分子流行病学特点，并对其进行基因同源性分析，有助于及时判断医院感染的传染源，明确传播途径，对预防和控制医院感染具有重要意义。本研究对重症监护病房(ICU)分离收集的62株金黄色葡萄球菌进行菌株鉴定及药敏试验，同时应用多位点序列分型技术(MLST)进行分子流行病学研究，采用eBURST软件分析其基因同源性，了解金黄色葡萄球菌在医院ICU的传播及流行状况，为临床合理使用抗菌药物及有效控制医院感染提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集某医院2013年3—8月ICU住院患者各种感染标本分离的62株金黄色葡萄球菌，并排除同一患者的重复菌株。

1.1.2 仪器与试剂 全自动细菌鉴定分析仪Phonenix 100(美国BD公司)，Mueller-Hinton琼脂培养基(北京奥博星生物技术有限公司)，溶葡萄球菌酶(BBI生命科学有限公司)，QIAamp DNA纯化试剂盒(德国凯杰公司)， DU800核酸蛋白分析仪(美国Beckman公司)，聚合酶链反应(PCR)扩增仪(美国ABI公司)，DNA凝胶电泳系统(美国Bio-Rad公司)，凝胶电泳成像系统(上海复日科技有限公司)，PCR反应所用试剂(上海生工生物工程股份有限公司)，药敏纸片(英国Oxoid公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离、鉴定 采用常规培养分离方法，操作方法依据《全国临床检验操作规程》，应用Phonenix 100 全自动细菌鉴定分析仪鉴定细菌。

1.2.2 药敏试验 药敏试验采用K-B法和头孢西丁纸片法，按美国临床实验室标准化协会(CLSI)2014年[3]规定的标准判定耐药(R)、中介(I)、和敏感(S)。

1.2.3 细菌DNA的提取 使用QIAamp DNA纯化试剂盒提取细菌DNA，首先对分离纯化得到的对数生长期的单菌落进行细菌DNA的提取，然后用Beckman DU800核酸蛋白分析仪检测提取的DNA纯度和浓度，确保提取的DNA质量。

1.2.4 引物的设计与合成 参照金黄色葡萄球菌MLST数据库(http://saureus.mlst.net/)推荐的7个独立的管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)设计引物[4]，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供，合成引物序列见表1。

表1 金黄色葡萄球菌MLST各管家基因引物序列及片段长度

Table 1 Primer sequence and fragment length of housekeeping genes ofS.aureusMLST

管家基因引物(5’-3’)片段长度(bp)arcCF:TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC456R:AGGTATCTGCTTCAATCAGCGaroEF:ATCGGAAATCCTATTTCACATTC456R:GGTGTTGTATTAATAACGATATCglpFF:CTAGGAACTGCAATCTTAATCC465R:TGGTAAAATCGCATGTCCAATTCgmkF:ATCGTTTTATCGGGACCATC429R:TCATTAACTACAACGTAATCGTAptaF:GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG474R:GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAAtpiF:TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA402R:TTTGCACCTTCTAACAATTGTACyqilF:CAGCATACAGGACACCTATTGGC516R:CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

1.2.5 PCR反应体系与扩增条件 PCR反应体系25 μL，其中Premix Taq 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板 2 μL，加无菌蒸馏水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.6 扩增产物的验证、测序与比对分析 首先通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，然后将PCR产物送北京柏林罗核酸技术有限公司进行双向测序，并利用BioEdit软件对测序结果进行校正、拼接。

1.2.7 MLST型别 拼接后的结果与金黄色葡萄球菌MLST数据库的数据进行比对分析，获得对应的7个管家基因的等位基因，然后根据7个等位基因型进一步获得该菌株的ST型别。

1.2.8 同源性分析 使用eBURST V3软件(访问地址：http://eburst.mlst.net)对62株金黄色葡萄球菌的ST基因型进行亲缘关系分析，借助BURST算法绘制类似于网络结构的辐射状图。本实验参考菌株为中国临床菌株，使用eBURST软件按照严格标准[4]绘制菌株ST亲缘关系分布图。

2 结果

2.1 菌株分布 62株金黄色葡萄球菌分离自神经外科ICU(26株)、神经内科ICU(16株)、消化科ICU(6株)、呼吸内科ICU(6株)、麻醉科ICU(4株)、心脏外科ICU(2株)、烧伤科ICU(1株)和儿科ICU(1株)，其中痰标本56株、咽拭子2株、分泌物、引流液、组织和粪便标本各1株。患者年龄0～94岁，平均48岁，男女性别比为1.95︰1(41/21)。

2.2 PCR扩增产物的鉴定结果 62株金黄色葡萄球菌均可以扩增出7个管家基因的特异性产物，扩增产物的大小为402 ～516 bp，扩增产物的电泳结果见图1。

图1 金黄色葡萄球菌管家基因PCR扩增电泳图

Figure 1 PCR amplification electrophoresis map of house-keeping genes ofS.aureus

2.3 MLST分型结果 62株金黄色葡萄球菌共分为10个ST基因型，其中2个基因型为新发现的ST型(STn1和STn2)，1个为国内新发现的ST型(ST675)。ST239是金黄色葡萄球菌主要的ST型别，占74.20%，且分布于6个ICU，分布范围最广。其次为ST5，分布于3个ICU。ST630与ST239相比较，仅管家基因arcC的等位基因不同。ST675和STn2与ST5相比较，分别表现为管家基因aroE和glpF不同。62株金黄色葡萄球菌MLST分型结果及其在各科室的分布情况详见表2。

表2 62株金黄色葡萄球菌科室分布及ST型别

Table 2 Department distribution and ST genotypes of 62S.aureusstrains

ST基因型等位基因谱(arcC-aroE-glpF-gmk-pta-tpi-yqil)科室分布株数构成比(%)ST2392-3-1-1-4-4-3神经外科ICU、神经内科ICU、烧伤科ICU、麻醉科ICU、呼吸内科ICU、消化科ICU4674.20ST51-4-1-4-12-1-10神经外科ICU、神经内科ICU、消化科ICU812.91ST204-9-1-8-1-10-8呼吸内科ICU11.61ST5919-23-15-2-19-20-15儿科ICU11.61ST1883-1-1-8-1-1-1神经内科ICU11.61ST63012-3-1-1-4-4-3心脏外科ICU11.61ST6751-36-1-4-12-1-10神经外科ICU11.61ST94418-18-6-59-13-15-18心脏外科ICU11.61STn11-4-1-23-12-240-10麻醉科ICU11.61STn21-4-327-4-12-1-10神经内科ICU11.61

2.4 药敏结果 62株金黄色葡萄球菌对头孢西丁耐药的MRSA共55株，占88.71%。所有菌株对11种常见抗菌药物的药敏结果见表3，只有敏感及耐药菌株，无中介菌株。46株ST239型金黄色葡萄球菌均为MRSA，表现出较强的耐药性；而ST20型、ST188型、ST944型和STn1型金黄色葡萄球菌对11种常见抗菌药物的敏感性相对较高。

表3 62株金黄色葡萄球菌对抗菌药物的药敏结果

Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of 62S.aureusstrains

抗菌药物检测株数耐药株数耐药率(%)敏感株数敏感率(%)头孢唑林625588.71711.29头孢西丁625588.71711.29阿米卡星444090.9149.09替考拉宁5900.0059100.00万古霉素6200.0062100.00利奈唑胺6100.0061100.00红霉素625588.71711.29克林霉素624572.581727.42左氧氟沙星625385.48914.52呋喃妥因6200.0062100.00利福平443681.82818.18

2.5 eBURST分析结果 eBURST分析结果显示，62株金黄色葡萄球菌10个ST型分布于中国临床菌株分群的6个克隆群和1个散点(新型别STn1)。见图2。在每个独立的克隆群中，不同的ST型别用长度不等的直线相连，直线的长度表示不同ST型别之间亲缘关系的远近。6个克隆群中，最大的克隆群为ST239克隆复合群，ST239为此克隆复合群中其他各ST型别共同的祖先(Founder)，ST630是ST239的一个亚群。第二大的克隆群为ST1克隆复合群，存在1个一级亚群(ST188)和1个二级亚群(ST2201)。在ST5克隆复合群中，本研究中的ST675、STn2均为中国临床参考菌株中第一次出现的新的ST型别。新发现的STn1因为不属于任何1个克隆复合群，在分析中以散点的形式分布。

*红色数字代表本研究和数据库均有的ST型；绿色数字代表仅在本研究中发现的ST型；黑色数字代表仅数据库中有的ST型

3 讨论

金黄色葡萄球菌是我国引起医院感染的重要病原菌之一，在该院也位居医院感染分离病原菌的前三位[5]。近年来，金黄色葡萄球菌的耐药率呈逐年升高趋势[6]，尤其是MRSA在医院感染中的比例大幅上升，导致临床抗感染治疗过程中可供选择的药物日益减少，使临床抗感染治疗变得更加棘手。研究[7]发现，2005年我国医院MRSA的平均分离率在50%左右，而上海的医院MRSA分离率可达78.4%。对金黄色葡萄球菌不同菌株间的亲缘关系进行分子生物学分析，可以帮助我们了解临床分离的金黄色葡萄球菌的传播特点和趋势，及时发现传染源和寻找传播途径，为有效预防和控制金黄色葡萄球菌医院感染暴发流行提供实验室依据。

本研究采用国际公认的MLST方法，对医院感染金黄色葡萄球菌进行基因分型[8]，该方法通过直接扩增金黄色葡萄球菌的多个管家基因，并将管家基因测序分析与数据库比对，从而确定菌株的基因型，获得的基因型可与国内外其他医院或实验室进行数据共享。MLST分型结果显示，62株金黄色葡萄球菌10个ST型共分布于6个克隆群和1个散点，其中ST239克隆复合群为流行优势菌群，占74.20%；其次为ST5克隆复合群，占总菌株的12.91%。该结果与Xiao等[9]的研究结果相符，该研究对中国大陆2011年27个省45个城市69家医院分离的1 141株MRSA菌株进行MLST分型，结果表明ST239克隆群为流行优势菌群(整体流行率为75.37%)，其次为ST5克隆群(整体流行率为12.62%)。Liu等[10]的研究报道，我国大部分地区MRSA流行株为ST239型菌株，说明该院金黄色葡萄球菌MLST分型结果与全国大部分医院的结果一致，以ST239克隆复合群和ST5克隆复合群为主，且菌株分布具有集中趋势。

金黄色葡萄球菌ST型别与科室分布关系显示，ST239为ICU患者感染的主要ST型别，分布于6个ICU，包括神经外科ICU、神经内科ICU、烧伤ICU、呼吸内科ICU、消化科ICU和麻醉科ICU，分布范围最广；而ST5的流行范围仅次于ST239，分布于3个ICU，包括神经外科ICU、神经内科ICU和消化科ICU。 62株金黄色葡萄球菌，主要分布于神经外科ICU (26株，41.94%)和神经内科ICU(16株，25.81%)；菌株来源主要为痰标本(56株，90.32%)，可能与大多数神经外科ICU和神经内科ICU的住院患者本身疾病有关，患者通常无正常吞咽和咳嗽的能力，痰难以咳出，细菌容易在痰中滋生和繁殖，从而容易发生坠积性肺炎[11]；同时，一部分患者由于接受了吸痰、气管插管和呼吸机辅助呼吸等具有侵入性的操作[12]，导致呼吸道的正常防御屏障遭到损害，从而导致肺部感染。

药敏试验和MLST分型结果显示，62株金黄色葡萄球菌中MRSA 55株(88.71%)，且MLST型别均属于ST239克隆复合体和ST5克隆复合体；而ST20、ST188、ST944和STn1型别菌株的药物敏感性却表现为对11种抗菌药物均敏感，由此推测菌株的药物敏感性与其遗传背景具有一定的相关性。对55株MRSA进行分析，发现其具有相似的耐药谱，进一步证明菌株间的遗传背景与药物敏感性相关。我们已将新发现的两株ST基因型菌株信息及其双向测序的峰图文件提交至MLST数据库，等待数据库最终命名。

综上所述，该院ICU感染的金黄色葡萄球菌以ST239基因型为主，且分布范围较广；菌株亲缘关系分析结果显示，62株金黄色葡萄球菌具有集中分布趋势，以ST239和ST5克隆复合群为主，两种克隆复合群具有相似的耐药谱；说明该院ICU金黄色葡萄球菌的感染存在医院内播散的趋势，该结果与之前的研究结果[13]相符。因此，我们应加强对临床医护人员的医院感染预防控制的教育，严格按照医疗器械污染后导致感染的风险高低选择相应的灭菌或消毒方法，及时采取有效的预防和控制措施，防止医院感染的暴发流行[14]。

本研究采用MLST方法进行细菌分子流行病学方面的研究，该方法由于具有操作简单、用时较少且便于比较等优点，现已被广泛应用于微生物的分型研究[15-16]。但由于本实验收集菌株数量相对较少，研究时间跨度相对较短，所以本研究结果在不同科室内是否存在主要ST型别尚未得出结论，需要完善实验设计，扩大样本量，开启多中心、多地区相关流行病学研究进一步验证。

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(本文编辑：孟秀娟)

Molecular epidemiological characteristics ofStaphylococcusaureusisolated in intensive care units

YANGYu-qi,XUXiu-li,MAYue-yun,SHIJie-ran,ZHOUShan,ZHOULei,HAOXiao-ke

(XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the molecular epidemiological characteristics and homology ofStaphylococcusaureus(S.aureus) isolated from patients in intensive care units (ICUs) of a hospital, so as to provide laboratory basis for the effective control of healthcare-associated infection(HAI). Methods 62S.aureusstrains isolated from various specimens from ICU patients with infection in March-August 2013 were collected, 7 housekeeping genes were amplified with polymerase chain reaction (PCR), the amplified products were sequenced, ST typing of strains was performed by multilocus sequence typing (MLST)， phylogenetic analysis of ST typing was conducted. Results 62S.aureusstrains were amplified specific product of 7 housekeeping genes; there were 10 ST genotypes, in which 2 ST genotypes(STn1and STn2) were first discovered，1 ST genotype(ST675) was first discovered domestically. ST239 was the main ST type ofS.aureusfrom ICU patients in this hospital, accounting for 74.20%，which distributed in 6 ICUs， ST5 distributed in 3 ICUs. 62 strains formed 7 main branches in the phylogenetic tree, 55 (88.71%) MRSA strains were detected. ConclusionS.aureusisolated from hospital ICUs has some homology, and the small number of types showed the trend of concentrated distribution.

intensive care unit；Staphylococcusaureus； multilocus sequence typing； gene; homology

2016-04-28

陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4188)；国家仪器重大专项(2012YQ03026107)

杨玉琪(1987-)，女(汉族)，陕西省西安市人，技师，主要从事临床微生物检验及病原菌分子流行病学研究。

郝晓柯 E-mail: haoxkg@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.001

R181.3+2 R378.1+1

A

1671-9638(2017)02-0099-05