外泌体内分子标志物检测及其临床应用

许文荣，孙瑶湘

(江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212013)

·述评·

外泌体内分子标志物检测及其临床应用

许文荣，孙瑶湘

(江苏大学医学院，江苏省检验医学重点实验室，江苏镇江 212013)

外泌体(exosome)是一类可由多种细胞分泌并包裹了蛋白质、mRNA、微小RNA(microRNA)、非编码RNA(lncRNA)、DNA、脂质等物质的膜性囊泡，研究发现exosome在细胞间通讯、肿瘤免疫、肿瘤治疗、组织损伤修复、疾病诊断中具有重要的意义。对不同来源的exosome携带的内容物进行分析并筛选其特异性的分子标志物，将为相关疾病的诊断及其发生发展的研究提供非常重要的帮助。Exosome可以在血液、尿液、唾液、胸腹水、乳汁、脑脊液、肺泡灌洗液等体液中被检出。随着exosome分离和分析检测技术的发展，越来越多分子标志物被发现，exosome内分子标志物有望为恶性疾病的早期诊断、预后判断提供新的依据。

外泌体；分子标志物；诊断

Exosome又称为外泌体或胞外体，早期由多泡体(MVB)通过膜内陷包裹内容物形成并在多泡体与细胞膜融合的过程中被释放到胞外,是一类粒径为30～120 nm，内含来源细胞中部分蛋白质、核酸、脂质等成分的蝶形膜性囊泡[1]。Exosome可由多种细胞如造血细胞、T/B淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、神经细胞、脂肪细胞及肿瘤细胞等分泌，并可在血液、尿液、唾液、胸腹水、乳汁、脑脊液、肺泡灌洗液等体液中被检出。不同细胞内包含的物质各不相同，其分泌的exosome的内容物也会存在差异，寻找exosome中组织特异性的分子标志物并比较疾病和健康状态下的差异将在临床疾病诊断过程中具有广阔的应用前景[2]，本文对exosome的分子标志物分析技术及其临床应用价值作简要述评。

1 Exosome的提取及分子标志物检测

Exosome常见的提取方法有超速离心法、蔗糖/碘克沙醇密度梯度离心法、商品化试剂盒ExoQuickTM、Total Exosome IsolationTM、磁珠分选法[3]等，Van Deun等[4]对前4种方法提取的exosome进行对比后发现蔗糖/碘克沙醇密度梯度离心法所提取的exosome蛋白质和脂质污染最少，磁珠分选特异性最高，但得率最低。还有学者利用多路复用微射流装置，通过调节电压，对表面携带电子的纳米粒子进行捕获，对提高exosome的纯度有很大帮助[5]。在临床应用中应根据实际情况如标本来源、数量、经济状况等选择相应的提取方法。Exosome常携带有膜融合蛋白(GTPases，annexins，Hotillin)、CD抗原(CD9，CD63， CD81， CD82)、热休克蛋白(Hsc70，Hsp90)、多泡体相关蛋白(Alix，TSG101)、脂质相关蛋白质和磷脂、核酸等物质。不同细胞来源exosome内部的成分各不相同，对这些成分的检出是进行疾病诊断的基础。蛋白质的检测方法主要有SDS-PAGE凝胶电泳、二维电泳、蛋白质芯片、免疫电镜、LC-MS/MS等。RNA包括mRNA、non-coding RNA(microRNA，lncRNA),其检测方法主要通过qRT-PCR、基因芯片和测序分析等。

2 Exosome的内标志物和疾病诊断

Exosome不仅能从培养细胞的上清中被提取，在血液、尿液、胸腹水、脑脊液、唾液、乳汁等体液中也容易获得。不同来源及不同生理状况下exosome内容物的差异提示可以将exosome作为疾病诊断的一种新方法。

2.1 血液exosome内标志物 血液标本较好反映了一些重大疾病如肿瘤，心血管病等疾病的病理情况，传统的EA，PSA，CA125，CA199等的检测存在特异性和灵敏度不高，对疾病早期诊断及预后判断帮助不够等问题。许多学者努力寻找新的血清标志物，如Eichelser等[6]发现三阴性乳腺癌(雌激素受体ER、孕激素受体PR和人表皮生长因子受体HER2均阴性)患者血清exosome中miR-373的表达量明显高于乳腺腔内乳腺癌患者，ER阴性乳腺癌患者血清exosome中miR-373水平也明显高于ER阳性的患者，相比于肿瘤抗原更具特异性。Gotanda等[7]发现通过免疫沉淀反应,用人体小肠和结肠特性表达的蛋白GPA33的抗体捕获肠道来源exosome,通过芯片筛选发现和乳腺癌耐药基因BCRP呈负相关的miR-328由该exosome包裹并能反应乳腺癌细胞中miR-328的含量，为评估BCRP的表达情况并对乳腺癌耐药及后续用药提供指导。Kuwabara等[8]发现急性心肌梗死和心绞痛患者血浆 exosome中 miR-1和 miR-133a的表达水平较健康人显著升高，对心血管疾病的早期快速诊断具有重要意义。此外，约有67%恶性黑色素瘤患者血浆中分离的exosome中能检出微囊蛋白-1，而通过传统LDH监测，阳性率只有7%[9]。食管鳞状细胞癌患者血清中exosome包含的miR-21水平高于良性食管肿瘤，且其表达水平的高低与肿瘤的分期及淋巴结转移相关[10]。结肠癌患者血清exosome中的let-7a、miR-1229、miR-1246、 miR-150、miR-21、miR-223及miR-23a表达量远高于非肿瘤患者和已进行肿瘤切除术的患者[11]。血清exosome中miR-629、miR-100和miR-154-3p则可以用于区分肺腺癌和肉芽肿。Stern等[12]通过比较78例运动员和16例非运动员血浆exosome中的tau蛋白含量，结果显示运动员组比非运动员组的exosome所含tau蛋白量更高，其特异性100%，灵敏度达83%。此外，tau蛋白含量越高，受试者记忆力检测的成绩越差，检测血浆exosome中tau样蛋白可以判断是否有过脑部外伤史，为慢性创伤性脑部伤的诊断和预后提供帮助。虽然血浆、血清标本中分子标志物直接检测与分析更为方便，但是，有些血清标志物如microRNA在exosome内含量更丰富且不易降解，因此，比较这两者的临床应用价值并选择更合适的检测方法用来指导临床疾病诊断值得引起更多关注。

2.2 尿液exosome内标志物 尿液标本常用于泌尿系统感染及肾脏功能检测，但由于外界环境因素,标本容易变质，常对检测结果影响较大。尿液取材容易且含有相对于细胞和尿蛋白来说性质更稳定的exosome，给泌尿系统疾病的检测提供了更好的手段。Ichii等[13]发现自身免疫性肾小球肾炎(AGS)患者尿液exosome中miR-26a含量增加。Abdeen等[14]发现用庆大霉素对大鼠进行腹腔注射诱导形成肾损伤，5 d后血浆肌酐升高，第7天出现多尿和尿比重失调现象,而由肾小球集合管通过exosome分泌到尿液中的水通道蛋白AQP2在肾损伤第1天即可检测到明显增高，到第7天才下降，其变化早于机体肾功能紊乱症状的出现。Spanu等[15]也发现氨基核苷嘌呤霉素诱导形成大鼠肾损伤，和正常组比较，第5天损伤组尿液exosome中的胱抑素mRNA表达量增高7.5倍。尿液exosome对前列腺癌的诊断具有指导意义，前列腺抗原(PSA)作为临床诊断前列腺癌的标志物已经30多年，而其敏感性和特异性并不能满足诊断需求，尿液exosome中生物学标志物的联合检测可能帮助医护人员和患者走出这一困境，Neeb等[16]发现前列腺癌患者尿液exosome中AGR2(主要由腺体分泌)的剪接体SV-G 和 SV-H表达量和良性肿瘤患者存在区别，且ROC曲线远优于检测血清PSA含量。Wang等[17]通过聚丙烯酰氨凝胶电泳及ELISA等方法检测到Flotillin2、Rab3B、LAMTOR1等蛋白在前列腺癌患者尿液exosome中表达量明显高于健康人，且特异性可达90%以上。因此，尿液exosome不仅能用于泌尿系统感染的诊断，还可能在无创情况下为其他疾病的早期诊断提供帮助。

2.3 脑脊液exosome内标志物 脑脊液是目前能够微创获取的最能反应神经系统状况的标本，研究发现脑脊液中也能提取exosome。Goetzl等[18]发现阿尔茨海默病患者(AD)exosome中的蛋白质转运受体如受体相关蛋白6(LRP6)、热休克因子-1(HSF1)、抑制因素1(REST)明显低于健康人，揭示了AD患者神经退行性变化的原因，是一个预测AD进展的指标。Fiandaca等[19]发现AD脑脊液exosome中磷酸化tau蛋白含量上调，反映了病情进展及预后。Exosome在帕金森病和亨廷顿舞蹈症的诊断中具有重要作用，帕金森病患者脑脊液exosome含有的α-synuclein、 LRRK2等蛋白是导致β-amyloid前体生成的重要蛋白质，若能对exosome中该蛋白质的含量进行分析是预测帕金森病进展的重要手段。对于AD和帕金森病的鉴别，Gui等[20]提出通过比较脑脊液exosome所含的microRNA含量，可以为该2种疾病更精确的诊断提供帮助。此外通过检测exosome分泌的亨廷顿蛋白也是预测亨廷顿舞蹈症的途径，为后续的治疗提供帮助[21-22]。exosome分子标志物将为神经方面疾病的研究和治疗提供新的实验室资料和依据。

2.4 腹水exosome内标志物 腹腔积液常见于腹部器官的病变如肝硬化、肝癌、卵巢癌、结肠癌等。Vaksman等[23]提出卵巢癌患者腹腔积液exosome中miRNA-21、23b、29a高表达常意味着高死亡率，而结肠癌患者腹水分离的exosome中claudin-3水平明显高于健康人对照[24]。Tokuhisa等[25]通过检测胃癌切除术患者腹腔灌洗液，胃癌转移瘤分离株培养上清，及胃癌卵巢转移患者腹腔灌洗液发现miR-21和 miR-1225-5p在胃癌转移标本中的表达量明显升高，这可能为胃癌侵犯腹腔及相关器官早期检测提供帮助。腹水中含有大量的蛋白质和核酸，腹部器官众多，这些物质的来源难以确定，仅从游离蛋白质核酸分析诊断疾病有一定的难度，而exosome具有组织特异性，在肿瘤组织的定位上更具优势，诊断的精准度也会更高。除了以上体液，唾液、肺泡灌洗液、卵泡液中也发现了exosome，在肿瘤、生殖功能、呼吸功能的诊断中显示其意义[26]。

3 其他及小结

Exosome作为一类能携带多种有生物学活性物质的膜性囊泡，在肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等的研究中颇受关注。Exosome参与了细胞间信号传导，调控了肿瘤的发生发展，对肿瘤免疫、耐药、预后有着重要的作用。

2型糖尿病患者血浆中携带CD41a、CD144/CD31、CD31/annexin V表面标志的exosome数量越多，预示合并产生动脉粥样硬化的可能性越大[27]。乳腺癌患者血浆exosome中的miR-141和 miR-195等指标对相应疾病的诊断有帮助。除了蛋白质、RNA、exosome内基因组DNA也具有肿瘤的诊断作用。Kahlert等[28]在胰腺癌患者血清exosome中检测到KRAS和p53的突变体，对胰腺癌的发生和发展起到指示作用。Exosome中也发现了lncRNA的存在，其在疾病诊断中作用目前报道极少，是否有诊断意义还需进一步研究。近期,Jin等[29]对极端物理环境处理下的血清exosome的内容物进行检测，发现其稳定性能很好地满足相关指标的检测，进一步为exosome用于疾病诊断打下了坚实的基础。Tavoosidana等[30]发现前列腺癌患者外周血中前列腺腺泡分泌的exosome含量和肿瘤恶性程度相关，且其含量越高，Gleason评分越高，预示前列腺癌恶性度越高。由此可见，exosome的浓度和内容物都可以为临床诊断提供帮助。分析exosome中蛋白质、RNA、DNA的组成可以确定其组织来源，进而分析疾病和健康状态下其他指标的差异就可以寻找到诊断的分子标志物。因此，通过提取体液中exosome作为诊断手段比单纯检测体液中游离的一些生物学指标更具特异性和敏感性。Exosome预示着细胞的病变，远早于组织和器官病变，对疾病早期诊断，分析良恶性，降低误诊率及减少侵入性检查的风险有意义。商品化试剂盒的出现使exosome的提取更加便捷，此外,尿液exosome的提取可以通过无须超速离心的方法，直接用特殊的滤膜即可将exosome吸附并对其进行后续分析[31]，而Khosravi 等[32]设计的微阵列可以直接捕获体液中的exosome，可能极大地推动微创诊断恶性疾病的进展。先进的提取技术及越来越多分子标志物的发现，会使exosome在疾病诊断领域的潜能越来越清晰，为恶性疾病的早诊断、早治疗、及预后判断开启新的篇章。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.01

许文荣，1963年生，男，教授，博士研究生导师，主要从事干细胞与肿瘤分子诊断研究，E-mail:icls@ujs.edu.cn。

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