肝细胞癌的血清学诊断——挑战与希望同在

鲁凤民

(北京大学基础医学院 病原生物学系, 北京 100191)

肝细胞癌的血清学诊断
——挑战与希望同在

鲁凤民

(北京大学基础医学院 病原生物学系, 北京 100191)

血清学指标因无创和操作简易的特点一直是肝细胞癌诊断的研究热点。简要介绍了传统血清学指标AFP在HBV感染相关肝癌辅助诊断和预后预测中的应用。评述了甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和异常凝血酶原/脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)等新指标的临床应用价值。通过一系列的文献回顾对血清高尔基体蛋白73(GP73)作为肝癌实验室辅助诊断的可能性提出质疑，并依据笔者的实验结果，提出了血清GP73测定或可作为进展期肝纤维化和肝硬化的实验室诊断指标的建议。

癌, 肝细胞； 肝硬化； 甲胎蛋白类； 甲胎蛋白异质体； 异常凝血酶原； 高尔基体蛋白73

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌(简称肝癌)，严重危害人类健康。最新数据显示，2012年全球共有78万人被诊断为肝癌，同年死于肝癌的人数为74万人，其中约50%来自中国[1]。原发性肝癌的致病因素主要有肝炎病毒(HBV、HCV)的慢性感染、黄曲霉毒素暴露、嗜酒等，其中由非酒精性脂肪性肝炎引起的肝癌呈明显的上升趋势[2-3]。近年来，虽然治疗手段有所进步，但肝癌的总体5年生存率仍远不尽人意，仅为10%左右[4]。除了肿瘤的恶性特征外，肝癌由于起病隐匿，发现时患者往往已失去治疗机会，也是导致肝癌患者生存率差的重要因素。因此，如何早期发现肝癌一直是医学界所面临的重要挑战。近年来，虽然基于影像学的肝癌诊断有了长足发展，但因其费用昂贵，基于血清学检测的早期肝癌筛查研究并未停歇。一些潜在的新型肿瘤标志物，如甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、异常凝血酶原(DCP，或PIVKA-Ⅱ)、高尔基体蛋白73(Golgi protein 73，GP73)等相继被应用于肝癌的筛查与临床辅助诊断。本文将对我国肝癌诊断和筛查的一些血清学新老指标的应用情况做一简要介绍。

1 AFP对乙型肝炎相关肝癌仍有一定的诊断和生存预测价值

自上世纪70年代发现AFP在原发性肝癌患者中升高以来，AFP一直被作为原发性肝癌的血清学诊断指标[5]。但该指标在早期肝癌筛查应用中存在一定的缺陷，例如约30%～40%的确诊肝癌患者AFP并未有明显升高，而在一些非肝癌患者中却有AFP升高。本实验室的回顾性研究发现，原发性肝癌和慢性肝病患者的血清AFP水平常有重叠，肝硬化中约有10%患者的血清AFP轻度升高 (20～200 ng/ml)，这种慢性肝病患者血清AFP升高的现象为其在高危人群中监测和早期发现肝癌造成一定困难和干扰。由于AFP在肝癌的筛查和诊断中存在灵敏度和特异度低的问题，近年来欧洲肝脏研究学会和美国肝病研究学会在其更新的诊疗指南中不再将AFP作为肝癌的筛查与诊断标准[6-7]。

肝癌在流行病学上呈现出明显的地域和人口学特征，不同地区的不同人群，致病因素也不尽相同。欧美国家的肝癌病因以HCV感染、酒精性和代谢性因素为主，而我国的HCC多与慢性HBV感染有关。HBx基因转录激活肝细胞AFP基因表达的前期研究结果[8]提示，AFP的肝癌诊断价值可能会受致病因素的影响。据此，笔者按致病因素的不同将肝癌患者分为HBV、HCV感染相关肝癌和其他非感染因素的肝癌，系统评价了在HBV感染背景下AFP对HCC诊断及预后预测的价值[9]。结果发现，AFP在HBV感染相关肝癌中仍然具有较好的诊断价值，其ROC曲线下面积为0.866，灵敏度为74.94%，特异度为86.29%。此外还发现，在HBV感染相关肝癌患者，其术前AFP越高，术后生存率越低，呈现出术后1、3、5年的生存率随术前AFP值升高而逐渐降低的趋势。这一现象未能在其他病因的肝癌中观察到，提示在用AFP作为肝癌的预后指标时应将HBV相关肝癌与非HBV感染肝癌区别对待。

AFP按照与小扁豆凝集素(lens culinaris aqqlutinin,LCA)的亲和度可分为结合型(AFP-L3)与非结合型(AFP-L1、AFP-L2)，其中AFP-L1主要存在于良性肝脏病变中，AFP-L2主要来自于孕妇，AFP-L3主要来源于肝癌细胞，尤其是肝动脉供血的癌组织细胞[10-11]。AFP-L3作为原发性肝癌的分子标志物被广泛研究并应用于临床实践。尽管有研究[12]表明，与单独AFP检测相比，联用AFP-L3可增加诊断的准确度，但一些荟萃分析[13-14]的结果显示，AFP-L3诊断HCC的准确度和灵敏度并不优于AFP。

2 异常凝血酶原

AFP在原发性肝细胞癌筛查和诊断中不尽人意，促使研究者努力尝试寻找新的，特别是早期肝癌的诊断标识。血清学指标由于取材方便，更是研究的重点。DCP是一种维生素K缺乏诱导蛋白，其γ-羧基谷氨酸结构中1个或多个谷氨酸残基不完全羧化为γ-羧基谷氨酸，导致其失去正常凝血功能。1984年Liebman等[15]首次提出DCP水平在肝癌患者中升高。近年来，大量临床研究表明DCP有较好的敏感度和特异度，因此DCP逐渐地作为肝癌筛查和诊断的指标用于临床诊断。Kim等[16]的研究发现，肿瘤直径≥5 cm的患者，血清DCP浓度显著升高，且DCP浓度与肿瘤TNM分期呈正相关性。笔者也发现，在HBV感染相关HCC患者中，高浓度的DCP与肿瘤直径呈现出明显的相关性。Ji等[17]基于大样本多中心研究发现，DCP诊断HBV相关HCC的敏感性明显优于AFP，尤其是对于早期肝癌的诊断。Li等[18]对49篇AFP及DCP诊断HCC的研究进行Meta分析，结果同样显示DCP诊断HCC的敏感度和特异度均优于AFP。由于AFP受多种因素调控，约1/3的HCC患者的血清AFP水平正常。而对于这些患者，DCP诊断肝癌的曲线下面积达到了0.834(95% CI：0.779～0.891)，灵敏度为 63.2%，特异度达90.7%，提示DCP对AFP阴性的HCC患者的早期筛查有一定的作用[17]。以上研究均提示，AFP与DCP两者间具有互补关系，其诊断肝癌的准确性明显优于DCP或AFP单独应用。因此，二者联用未来将是国内外常用的诊断模式。尽管如此，DCP作为HCC的早期筛查指标仍有其缺陷，如果患者维生素K缺乏、饮酒或者服用华法林等抗凝剂均可导致DCP的异常升高，在临床应用中，要充分考虑到这些因素，避免其对诊断结果造成干扰。

3 GP73不具有对肝癌的诊断价值，却是肝硬化诊断的良好指标

GP73是一个有402个氨基酸、相对分子量为73 kD的跨膜糖蛋白，又称为Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgi phosphoprotein 2，Golph2)和高尔基体膜蛋白Ⅰ(Golgi membrane protein 1，Golm1)。在正常肝组织中，GP73主要在胆管上皮细胞内表达，而肝细胞表达很少甚至不表达。GP73由于在肝癌患者血清中异常升高，被推荐作为原发性肝癌的诊断指标应用于临床[19]。但在后期的临床应用中发现，进展期肝纤维化及肝硬化患者血清GP73亦明显升高。例如，笔者的相关研究[19]结果显示，尽管HCC患者血清中GP73水平[(121.30±2.47)ng/ml]远高于无肝硬化的慢性肝病患者[(45.86±0.80)ng/ml](P<0.001)，但与肝硬化患者[(139.25±2.20)ng/ml]相比，两者间并无差别(P=0.139)。提示血清GP73检测难以鉴别肝硬化和肝癌，而肝硬化患者恰恰是肝癌的高风险人群，因此血清GP73就失去了对肝癌的诊断价值。与之一致，以肝硬化患者为对照，血清GP73用作HCC诊断的ROC曲线下面积仅为0.613(95%CI：0.595～0.630，P<0.001)，几乎没有诊断价值。为了进一步说明血清GP73水平与肝癌无相关性，笔者进一步对术后半年内无复发的肝癌患者肝癌切除前后的血清GP73水平变化进行对比，发现不同于血清AFP在术后的明显下降，血清GP73水平在肝癌瘤块切除前后基本保持不变，提示血清GP73水平与肿瘤是否存在没有关系。进一步的多因素logistic回归模型分析结果也证明了这一点，血清GP73水平与HCC患者肿瘤大小、分化程度、TNM分期及AFP等肿瘤生物学特征无关。更为重要的是，免疫组织化学染色发现，血清GP73水平仅与癌旁组织GP73阳性细胞数及蛋白质水平相关，与肿瘤细胞的GP73表达水平无相关性。与之形成鲜明对照的是，笔者发现这些肝癌患者的血清GP73的水平与患者的肝纤维化及肝硬化相关指标，如肝纤维化四项、血清GGT、总胆汁酸、凝血酶原时间及前白蛋白等密切相关(P<0.001)。

笔者实验室后续开展的一系列研究[20-26]发现，在不同病因所致的肝纤维化、肝硬化患者中，血清GP73水平随进展期肝纤维化及肝硬化的严重程度逐步升高，能够将进展期肝纤维化、早期肝硬化与慢性肝病区分开来。进一步分析其对肝硬化的诊断价值发现，血清GP73诊断代偿期肝硬化的曲线下面积为0.909(95%CI ：0.896～0.921)(P<0.0001)，灵敏度为79.97%，特异度为92.43%，与肝脏弹力指数(LSM)、APRI及FIB-4对代偿期肝硬化的诊断价值相当。值得注意的是，在LSM测量准确性容易受到影响的肥胖(BMI≥28)、脂肪肝、肝组织炎症活动度≥2、ALT有1～2倍升高、TBil及总胆汁酸升高的患者中，血清GP73对代偿期肝硬化的诊断价值高于LSM。此外，血清GP73对于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝以及其他原因引起的代偿性肝硬化的诊断曲线下面积均在0.900以上。以上结果显示血清GP73对代偿期肝硬化有较好的诊断价值。进一步分析具有肝活组织检查的临床样本，结果发现血清GP73可在一定程度上作为反映肝纤维化严重程度的有效血清学诊断指标，其在不同病因慢性肝病所致肝纤维化、肝硬化的诊断、预后评估及慢性肝病动态监控等方面均有潜在的临床应用价值。

总之，在现阶段我国的原发性肝癌仍以慢性HBV感染为主要致病因素的情况下，AFP在肝癌的诊断和预后评估上仍有较好的应用价值，DCP作为一个新的血清学指标，其诊断价值与AFP相当。AFP和DCP联合检测，可在一定程度上改善原发性肝癌实验室诊断的现状。血清GP73由于其在肝硬化阶段存在普遍的异常升高，不推荐应用于原发性肝癌的实验室诊断。

[1] TORRE LA, BRAY F, SIEGEL RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108.

[2] EL-SERAG HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2012, 142(6): 1264-1273.

[3] EL-SERAG HB, KANWAL F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? where do we go?[J]. Hepatology, 2014, 60(5): 1767-1775.

[4] TREPO C, CHAN HL, LOK A. Hepatitis B virus infection[J]. Lancet, 2014, 384(9959): 2053-2063.

[5] HEYWARD WL, LANIER AP, MCMAHON BJ, et al. Early detection of primary hepatocellular carcinoma. Screening for primary hepatocellular carcinoma among persons infected with hepatitis B virus[J]. JAMA, 1985, 254(21): 3052-3054.[6] BRUIX J, SHERMAN M. Management of hepatocellular carcinoma: an update[J]. Hepatology, 2011, 53(3): 1020-1022.

[7] European Association for the Study of the Liver, European Organisation for Research and Treatment of Cancer. EASL-EORTC clinical practice guidelines: management of hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2012, 56(4): 908-943.

[8] ZHANG C, CHEN X, LIU H, et al. Alpha fetoprotein mediates HBx induced carcinogenesis in the hepatocyte cytoplasm[J]. Int J Cancer, 2015, 137(8): 1818-1829.

[9] YAO MJ, ZHAO JM, LU FM. Alpha-fetoprotein still is a valuable diagnostic and prognosis predicting biomarker in hepatitis B virus infection-related hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(4): 3702-3708.

[10] YAMAMOTO K, IMAMURA H, MATSUYAMA Y, et al. AFP, AFP-L3, DCP, and GP73 as markers for monitoring treatment response and recurrence and as surrogate markers of clinicopathological variables of HCC[J]. J Gastroenterol, 2010, 45(12): 1272-1282.[11] NAKAGAWA T, MIYOSHI E, YAKUSHIJIN T, et al. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients[J]. J Proteome Res, 2008, 7(6): 2222-2233.

[12] JIA ZL， WANG L, LIU C, et al. Clinical significance of alpha-fetoprotein variant in diagnosis of liver cancer[J]. China Cancer, 2010, 19(10): 686-688. (in Chinese)) 贾志凌， 王莉， 刘畅， 等. 甲胎蛋白异质体对肝癌诊断的临床意义[J]. 中国肿瘤, 2010, 19(10): 686-688.

[13] HU B, TIAN X, SUN J, et al. Evaluation of individual and combined applications of serum biomarkers for diagnosis of hepatocellular carcinoma: a meta-analysis[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(12): 23559-23580.[14] YI X, YU S, BAO Y. Alpha-fetoprotein-L3 in hepatocellular carcinoma: a meta-analysis[J]. Clin Chim Acta, 2013, 425: 212-220.

[15] LIEBMAN HA, FURIE BC, TONG MJ, et al. Des-gamma-carboxy (abnormal) prothrombin as a serum marker of primary hepatocellular carcinoma[J]. N Engl J Med, 1984, 310(22): 1427-1431.

[16] KIM DY, PAIK YH, AHN SH, et al. PIVKA-II is a useful tumor marker for recurrent hepatocellular carcinoma after surgical resection[J]. Oncology, 2007, 72 (Suppl 1): 52-57.

[17] JI J, WANG H, LI Y, et al. Diagnostic evaluation of des-gamma-carboxy prothrombin versus alpha-fetoprotein for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma in China: a large-scale, multicentre study[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e153227.

[18] LI C, ZHANG Z, ZHANG P, et al. Diagnostic accuracy of des-gamma-carboxy prothrombin versus α-fetoprotein for hepatocellular carcinoma: a systematic review[J]. Hepatol Res, 2014, 44(10): e11-e25.

[19] MAO Y, YANG H, XU H, et al. Golgi protein 73 (GOLPH2) is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma[J]. Gut, 2010, 59(12): 1687-1693.

[20] ZHU YW, YAO MJ, LV QJ, et al. Diagnostic evaluation of serum Golgi protein 73 (GP73) for cirrhosis among Chinese chronic hepatitis C patients[J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s1013-s1014.

[21] WANG L, YAO MJ, ZHAO JM, et al. Golgi protein 73: a valuable serum marker for the diagnosis of fibrosis and cirrhosis of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s60.[22] YAO MJ, ZHAO JM, LU FM. Serum Golgi protein 73 is not a valuable diagnostic marker for hepatocellular carcinoma [J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s172-s173.

[23] YAO MJ, ZHAO JM, LU FM. Serum Golgi protein 73 is a valuable diagnostic biomarker in HBV infection-related significant fibrosis and early cirrhosis[J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s922-s923.

[24] WANG LJ, LI YM, YAO MJ, et al. Serum Golgi protein 73 is a valuable non-invasive marker for the diagnosis of fibrosis and cirrhosis in patients with autoimmune liver diseases[J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s924-s925.

[25] LI MY, YAO MJ, ZHAO JM, et al. Serum golgi protein 73 values to the early diagnosis of autoimmune liver diseases-related cirrhosis [J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s925.

[26] YAN Y, YAO MJ, ZHAO JM, et al. Diagnostic evaluation of serum golgi protein 73 (GP73) for alcoholic liver cirrhosis among Chinese patients[J]. Hepatol Int, 2017, 11(Suppl 1): s201-s202.

引证本文：LU FM. Serological diagnosis of hepatocellular carcinoma: challenges and opportunities[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1262-1265. (in Chinese) 鲁凤民. 肝细胞癌的血清学诊断——挑战与希望同在[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(7): 1262-1265.

(本文编辑：刘晓红)

Serological diagnosis of hepatocellular carcinoma: challenges and opportunities

LUFengmin.

(DepartmentofPathogenicBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,PekingUniversity,Beijing100191,China)

Serological markers have the features of noninvasiveness and simple operation and thus have become a research hotspot in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. This article briefly introduces the role of the conventional serological marker alpha-fetoprotein (AFP) in assisting the diagnosis and predicting the prognosis of HBV-related liver cancer, as well as the clinical value of new markers such as alpha-fetoprotein-L3 and abnormal prothrombin/des-γ-carboxy prothrombin. Based on literature review, the possibility of serum Golgi protein 73 used for laboratory auxiliary diagnosis of hepatocellular carcinoma has been denied. The results of the author′s experiment suggest that serum GP73 measurement can be used as a laboratory diagnostic index for progressive liver fibrosis and liver cirrhosis.

carcinoma, hepatocellular； liver cirrhosis； alpha-fetoproteins； alpha-fetoprotein-L3； des-gamma-carboxynprothrombin； Golgi protein 73

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.011

2017-05-12；

2017-05-27。

鲁凤民 (1963-)，男，教授，博士，主要从事HBV及其相关肝病研究。

R735.7

A

1001-5256(2017)07-1262-04