分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用

张晨曦(上海师范大学，上海 200235)

分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用

张晨曦(上海师范大学，上海 200235)

微生物多样性研究是生物多样性研究中的重要内容，由于微生物与动植物相比，存着这许多不同之处，因此其多样性研究也存在着许多不同之处，尤其是研究方法仍有待提升。近些年来，越来越多的研究通过分子生物学方法观察微生物并取得了一定的成效。因此，文章主要针对分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用价值展开分析。

分子生物学方法；微生物多样性；遗传多样性

微生物主要包括细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒，是构成自然界的重要组成部分，其具有代谢多样性和遗传多样性，使得微生物在许多极端环境中都能够生存、繁衍。微生物是生物链中的重要成员，对于动植物的生长发育、生态循环以及污染物的自然降解具有重要作用[1]。微生物种类数量仅次于昆虫，但目前已知微生物种类占其总估计量的比重仍较低，目前生物界中已知的细菌、真菌以及病毒占其总种类的比重仅有6%、11%和5%，微生物多样性的研究滞后于其他生物群。

1 微生物多样性研究的重要性

微生物在维持生态平衡中具有重要作用，但是我们对于维持生态平衡的微生物系统的结构以及有关参数知之甚少，究其原因是由于传统微生物培养方法是通过获得培养菌株才能了解其特征，但是在自然界中能够培养的微生物数量还不到微生物总量的百分之一。传统微生物研究主要是通过观察菌株的表性特征以及细胞的性质（包括细胞形态学、生理生化反应以及细胞组成成分等方面）[2]。由于实验室培养是观察这些微生物特征的重要前提，因此这使得许多无法培养的微生物都不能被具体描述。此外，这种研究方式对于微生物的进化关系没有有效的作用，因此微生物进化研究受到影响，从而无法对微生物进行准确的分类以及系统关系图的创建。DNA技术以及微生物分子学的出现为微生物研究提供了新的道路，有助于现代微生物多样性研究的良好开展。

从理论层面上分析，微生物进化之间的关系主要是由于基因组的结构决定的，通过比较微生物基因序列之间的不同能够有助于分析微生物之间的进化关系，比较简单的方法就是比较不同微生物类似基因之间的碱基序列，碱基序列之间的差距越大，说明微生物之间的进化关系也就越小。该方法可以用于分析不同微生物之间的进化距离，从而用于构建进化关系树或微生物图谱[3]。在微生物多样性研究中发现，16S rRNA以及18S rRNA的变化速率较低慢，常用于微生物进化关系分析的检验中。近些年来，随着微生物DNA技术的不断发展，以核酸基因序列为依据的微生物进化研究获得了有效的进步。现代分子生物学技术的出现突破了传统研究技术的限制，从遗传角度上能够分析出微生物的种类以及遗传多样性。

2 分子生物学方法在微生物多样性研究中的理论基础

2.1 “三界”理论的提出

生物学界在对古化石标本研究中发现，早在30亿年前地球上就有自养细菌的存在，20多亿年前地球上出现了蓝细菌，15亿年前真核生物首次出现在地球上，也就是说原核生物比真核生物出现的要更早，真核细胞是由原核细胞进化而来也是一种比较科学的结论，这也是生物学界早期生命进化的主流理论[4]。这一学说认为所有的生命都可以划分为这两种类型，且如今的真核生物就是由原核生物进化发展而来。

分子生物学方法的应用对于改正现代微生物种类划分以及进化关系等方面具有较好的效果。进三十年来，大量的细胞生物学研究和分子生物学的研究证实，原核生物早在数亿年前就已经分化为真细菌和古细菌这两大类。过去在建立微生物进化树时，主要是根据微生物细胞色素C中氨基酸组成变化的特点，这主要是由于真核生物与大部分原核生物都有细胞色素C。但是在研究中发现，有些古细菌没有细胞色素C，而有些细菌虽然有细胞色素C，但是其氨基酸组成之间的差异过大，无法确定其是否有着进化关系[5]。通过rRNA的序列结构确定微生物之间的进化关系为微生物多样性的研究提供了更广阔的空间。

“三界”理论是由学者沃瑟提出的，其认为原核生物应分为古细菌与真细菌两界，但两界彼此之间有着很大的差异，也就是说古细菌、真细菌与真核生物三者是相互平行的，三者都起源于共同的原始细胞。三界学说随着研究的进步而不断发展，大量古标本生物分子研究证实了古核生物遗传基因与真核生物有相似之处，古细菌与真核生物从进化学角度来看比原核生物更加密切，因此近些年来有越来越多的学者支持真核生物起源于古细菌的学说，认为真细菌是最先从古细菌与真核生物的生物干线中分离出来的。“三界”理论的提出为为生物多样性的研究提供了全新的视角，并提示微生物遗传多样性具有普遍性。

2.2 16S rRNA基因序列在分子生物学中的应用

佩斯等人首次通过rRNA基因鉴定样本中微生物的类别，利用5S rRNA基因序列分析微生物的演变与进化。该方法取得了一定的成效并且很快被用于研究微生物多样性。但是由于5S rRNA的基因序列相对较小，仅有120个核苷酸，携带信息不多，在微生物多样性研究领域起到的作用有限，而16S rRNA基因序列与5S rRNA基因序列相比，其携带信息更多，有1500个核苷酸，在分析微生物多样性方面的作用与效率更高。16S rRNA是原核生物中的一种RNA，具有种类少且范围广的优点，约有80%细菌RNA中含有16S rRNA，适用于所有的生物中，从结构和功能上来看具有较强的保守型，被称为细菌化石。16S rRNA既能够表现出不同菌属之间的差异，同时又能够被分子生物技术所测量，因此得到了生物学家的广泛支持。细菌16S rRNA中的可变区序列都是根据细菌的菌属来确定的，恒定区序列相对比较稳定，因此可以利用恒定区序列将16S rRNA片段进行扩增处理，利用不同细菌的可变区序列进行菌属和菌种的鉴定。通过对16S rRNA基因序列的分析，从而判断不同菌属、菌种之间进化关系的密切程度。16S rRNA序列同源性分析是推断细菌进化和发展的重要方法。

3 分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用

随着科学技术的不断发展，DNA技术成为遗传学研究中的重要方法。近些年来，从样本中采集和提取DNA的方法不断改进，从而对样本中的微生物进行聚合酶链式反应扩展，推动了微生物多样性研究的发展。因此，文章针对分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用展开阐述。

3.1 分子杂交技术

分子杂交技术是出现于1970年的分子生物学技术，其主要利用DNA分子碱基相互配对的原理，利用特异性C DNA探针与样本中的DNA或RNA形成杂交分子，其具有较高的特异性和敏感度，在微生物多样性研究中得到了广泛的应用。目前实验中主要使用的探针有双链DNA、单链DNA和RNA、寡核苷酸探针这三种，能够对微生物能否存在于特定环境、分布特点以及元素丰度等方面进行确定。

对采集到的微生物进行印迹杂交，能够获得特定DNA序列的信息，主要原理是利用16S rRNA基因探针与采集的为神武进行杂交，16S rRNA相对丰度能够通过两者之间的杂交信号确定，从而间接反应微生物细胞的数量和生理特征。对采集样本直接进行原位杂交，然后利用具有荧光标记的核酸片段作为探针，与样本染色体和细胞核进行DNA杂交，就能够寻找到同源DNA片段所在位置，实现了细胞DNA序列的定位。该技术能够从未知菌种获得大量的信息，包括微生物形态以及生物结构等方面的信息。但是由于是对环境样本的检测，所获得的理论更加能够凸显自然环境中微生物的特点。这种方法应用的关键是前期探究工作的不断累积，尤其是对已知微生物。全细胞杂交比印迹杂交更加直观，其主要是通过放射性标记rRNA探针来检查单个微生物细胞。

3.2 PCR技术

PCR技术也就是聚合酶链式反应技术，其主要利用双链DNA变性与复性及分子杂交技术。PCR技术是一种快速扩增特定基因或DNA序列的方法，能够将少量DNA特异性扩增，通过多次解链以及反复循环，能够将基因或DNA序列扩增十几倍，从而对采集DNA样本进行分析，包括基因分析、序列分析以及进化分析等。目前学界采用最广的是以16S rRNA基因为基础的PCR扩增，对微生物基因序列的扩增有助于分析微生物进化的多样性。

PCR技术仅需要少量DNA即可进行检测。所选取的扩增模版DNA片段要符合规范，若扩增不科学，可导致推断错误，一般来说，引物应当出现于分析基因序列的高度保守区，多在15～30bp区间。采用双链产物作为PCR扩增模版，通过控制两种引物的含量，能够扩增出特定的DNA序列。单链构象多态技术主要是根据不同构象的DNA单链在中性物质中的变迁率来观察DNA基因的多样性。若单链DNA出现单碱基缺失时，迁移率会产生相应的变化，从而在谱带中出现多样性变化。该技术所采用的方法主要分为PCR扩增和凝胶分离这两方面，典型的单链构象多态技术需要在PCR扩增中加入典型ATP标记引物或CTP标记引物才能进行扩增，扩增完毕之后通过放射观察单链构象的多态变化。但是这种方法花费的时间与经费较大，且操作复杂，随着近些年的技术改进，采用印染显色以及溴化乙锭染色能够直接在中性凝胶中显示单链构象多态性，并且能够采用同为标记引物进行测验，使得该技术更加快捷和有效。单链构象多态技术的优点在于：①能够检测到单碱基的基因突变；②方便快捷，适用于多样本筛查中。但是该技术也有一定的缺陷，即其对小片段PCR扩增产物较为敏感，对于大片段PCR扩增产物的检验需要采用双向凝胶电泳进行分析。

4 结语

微生物多样性的传统研究方法是提取为环境样本中的微生物进行实验室培养和鉴定，但是自然界中的微生物种类非常多，能够采集到的微生物有限，且能够进行实验室培养的微生物更是少之又少，仅为微生物的1%。近些年来随着DNA技术的不断发展，通过DNA技术来观察微生物菌属和种类的研究得到了较大的发展，这为微生物多样性的研究提供了新的方向。

[1]杨永华,姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用[J].生物多样性,2014,8(3):337-342.

[2]谭益民,何苑皞,郭文平等.基于分子技术的土壤微生物多样性研究进展[J].中南林业科技大学学报,2014,23(10):1-9.

[3]卢莉琼,徐亚同,梁俊等.分子生物学方法在微生物多样性及微生物生态研究中的应用[J].应用与环境生物学报,2014,10 (6):826-830.

[4]燕艳,陈健,燕昌江等.利用分子生物学技术鉴定土壤微生物的方法[J].东北农业大学学报,2014,39(3):129-133.

[5]李慧,陈冠雄,张颖等.分子生物学方法在污染土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报,2014,41(4):612-617.

张晨曦男汉族籍贯：河南省周口市 在读上海师范大学研究生三年级、微生物学专业、研究方向：分子生物学、邮编：200235